孔吸附樹脂分離純化補(bǔ)骨脂黃酮的研究

1、孔吸附樹脂分離純化補(bǔ)骨脂黃酮的研究    【摘要】     目的篩選適合分離純化補(bǔ)骨脂黃酮的大孔吸附樹脂并確立純化工藝參數(shù)。方法以樹脂對(duì)補(bǔ)骨脂黃酮的吸附量和解吸率為考察指標(biāo)，選用7種型號(hào)的大孔吸附樹脂進(jìn)行純化。結(jié)果LSA-21樹脂吸附和解吸效果最佳，最優(yōu)工藝條件為:補(bǔ)骨脂黃酮上樣液的質(zhì)量濃度為1.4491.736 mg/ml，吸附流速為1 ml/min，洗脫劑為90%乙醇，洗脫流速為1 ml/min，洗脫劑用量為8倍柱床體積。結(jié)論LSA-21樹脂在所確定的工藝條件下，可較好地分離純化補(bǔ)骨脂黃酮。 

2、0;   【關(guān)鍵詞】  補(bǔ)骨脂 黃酮 大孔吸附樹脂    Study on the Isolation and Purification of Flavonoids from Psoralea corylifolia with Macroporous ResinZHANG Xiaoxi, LI Chongjiu, ZHANG Zhuang, WANG Ying, LI NanDepartment of Applied Chemistry, China Agricultural University, Beijing

3、 100193, ChinaAbstract:ObjectiveTo screen the suitable resin for purification of flavonoids from Psoralea corylifolia and to establish the optimum technological parameters of purification. MethodsAccording to the absorption capacity and elution ratio of the resin, seven types of macroporous resin we

4、re used to purify the flavonoids from Psoralea corylifolia. ResultsThe results indicated that the absorption capacity and elution ratio of LSA-21 type of macroporous resin were the best in these types of macroporous resin. The optimum extraction conditions were that the concentration and the current

5、 velocity of the original solution were 1.4491.736 mg/ml and 1 ml/min. The eluant was 90% ethanol and the eluting velocity was 1 ml/min. The consumption of eluant was 8 times bed volume.ConclusionIn this condition, LSA-21 type of macroporous resin showed good isolation and purification capability of

6、 the flavonoids from Psoralea corylifolia.Key words:Psoralea corylifolia;  Flavonoids;  Macroporous absorption resin中藥補(bǔ)骨脂始載于開寶本草，為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實(shí)，別名破故紙、黑故子、胡故子等，其性溫，味辛，具補(bǔ)腎助陽之功效。在傳統(tǒng)的中醫(yī)臨床上主治腎虛冷瀉，陽痿，小便頻數(shù)，腰膝冷痛，虛寒喘咳等病癥。據(jù)現(xiàn)代研究表明，補(bǔ)骨脂還具有抗腫瘤，抗菌，抗骨質(zhì)疏松，雌激素作用以及治療白癜風(fēng)等多重藥理活性。補(bǔ)骨脂所具有的

7、這些藥理活性與其所含的活性成分有著密切聯(lián)系1。補(bǔ)骨脂中的化學(xué)成分主要為香豆素類和黃酮類，也含有單萜酚類。本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹脂法對(duì)補(bǔ)骨脂中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行純化富集，通過對(duì)7種樹脂的靜態(tài)吸附解吸和動(dòng)態(tài)吸附解吸篩選實(shí)驗(yàn)，尋找到對(duì)補(bǔ)骨脂黃酮具有較好吸附解吸性能的樹脂，并研究了該樹脂吸附解吸的工藝條件。此采用大孔吸附樹脂對(duì)補(bǔ)骨脂中黃酮物質(zhì)進(jìn)行純化富集的研究還未見報(bào)道。該研究為補(bǔ)骨脂黃酮的分離純化提供了實(shí)驗(yàn)方法并為大量生產(chǎn)中的應(yīng)用提供技術(shù)參數(shù)。1 儀器與材料722光柵分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；BP211D型電子分析天平，德國sartorius

8、公司；恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司。補(bǔ)骨脂藥材，購于同仁堂藥店。蘆丁對(duì)照品(純度為99.76%)，南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所，批號(hào)：TCM027-080118；XDA-1，SP825，LSA-21，D101，AB-8，LSA-30，D4020樹脂，日本三菱（購于北京慧德易科技有限公司）；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 黃酮含量的測(cè)定2.1.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線2精密稱取蘆丁對(duì)照品21.02 mg，加60%乙醇充分溶解，置于100 ml容量瓶中，定容即得對(duì)照品溶液。分別移取蘆丁對(duì)照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml置于25 ml容量瓶

9、中，用60%乙醇補(bǔ)充至6 ml，加5%亞硝酸鈉1 ml，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁1 ml，搖勻，放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min后以第1份作為對(duì)照于505 nm（經(jīng)全波長(zhǎng)掃描確定505 nm為最大吸收波長(zhǎng)）波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:A=0.012 9 C-0.012 9，r=0.999 9，線性范圍：8.38850.33 g/ml。見圖 1。2.1.2 補(bǔ)骨脂樣品液的制備及黃酮含量測(cè)定將補(bǔ)骨脂藥粒粉碎，稱取補(bǔ)骨脂藥粉12 g，加10倍量90%乙醇加熱回

10、流提取3次，2 h/次，過濾，合并濾液3，用90%乙醇稀釋至500 ml，作為樣品溶液。量取0.5 ml于25 ml容量瓶中，按“2.1.1”項(xiàng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下進(jìn)行操作，測(cè)定并計(jì)算其黃酮含量。2.2 大孔吸附樹脂預(yù)處理所用樹脂均先用95%乙醇浸泡24 h，使樹脂顆粒充分溶漲，然后用95%乙醇洗滌至洗出液與水混合不呈白色渾濁為止，再用去離子水洗至無醇味2。2.3 樹脂的篩選42.3.1 樹脂靜態(tài)吸附量和解吸率的測(cè)定稱量處理好的XDA-1，SP825，LSA-21，D101，AB-8，LSA-30，D4020樹脂各1 g，分別置于50 ml帶磨口塞的三角瓶中，精密加入補(bǔ)骨脂樣品液10 

11、ml，置振蕩器上振搖，24 h后取1 ml上清液至25 ml容量瓶，測(cè)定并計(jì)算吸附后的溶液剩余濃度。按下式計(jì)算各樹脂室溫下的吸附量（mg/g）:吸附量=(起始濃度-剩余濃度)×溶液體積/樹脂質(zhì)量。    經(jīng)靜態(tài)吸附后的樹脂過濾抽干，分別精密加入90%乙醇10 ml解吸，相同條件下振搖24 h后取1 ml上清液至25 ml容量瓶，測(cè)定并計(jì)算解吸液濃度。按下式計(jì)算解吸率:解吸率（%）=（解吸液濃度×解吸液體積）/吸附量×100%。結(jié)果見表 1。表1  大孔吸附樹脂對(duì)補(bǔ)骨脂黃酮的靜態(tài)吸附量與解吸率（略）2.3.2 樹脂動(dòng)態(tài)吸附率和

12、解吸率的測(cè)定取已處理好的7種樹脂各6 g濕法裝柱，測(cè)量其柱床體積為10 ml，加等柱床體積10 ml補(bǔ)骨脂樣品液于柱頂，以相同流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，然后用等量去離子水清洗樹脂床中未被吸附的成分，一并收集流出液。測(cè)定并計(jì)算流出液的濃度，按下式計(jì)算樹脂的吸附率：吸附率（%）=(樣品液濃度×樣品液體積)-(流出液濃度×流出液體積)/(樣品液濃度×樣品液體積)    將上述充分吸附后的樹脂分別用等量90%乙醇以相同的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測(cè)定并計(jì)算洗脫液中黃酮濃度，計(jì)算解吸率(%)。結(jié)果見表2。表2  大孔吸附樹脂對(duì)補(bǔ)骨脂黃酮的動(dòng)態(tài)

13、吸附率與解吸率（略）由表1，2結(jié)果可以看出，7種大孔吸附樹脂中LSA-21在靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)中均具有較好的吸附能力和解吸能力。XDA-1樹脂和SP825樹脂雖然在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)篩選實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)較好的吸附能力，但其解吸率均較低，不適合補(bǔ)骨脂黃酮的分離純化；在動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)中解吸率略高于LSA-21樹脂的D101樹脂其吸附能力不如LSA-21樹脂且其靜態(tài)吸附解吸能力均不如LSA-21樹脂。因此結(jié)合靜態(tài)篩選實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)篩選實(shí)驗(yàn)，綜合考慮，確定LSA-21樹脂是分離純化補(bǔ)骨脂黃酮效果較好的樹脂。2.4  LSA-21樹脂分離純化補(bǔ)骨脂黃酮的動(dòng)態(tài)吸附解吸工藝條件優(yōu)化572.4.1 最佳上

14、樣濃度的確定將6種不同濃度的樣品溶液10 ml（一個(gè)柱床體積）分別以相同流速通過LSA-21樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。然后用等量去離子水清洗樹脂中未被吸附的成分，一并收集流出液。測(cè)定并計(jì)算流出液的濃度，計(jì)算黃酮吸附率，確定最佳上樣濃度。結(jié)果見表 3。表3  上樣濃度對(duì)黃酮吸附率的影響（略）    從表3可以看出，隨著樣品濃度的增加，吸附率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。在較低濃度時(shí)，樹脂對(duì)補(bǔ)骨脂黃酮的吸附率隨上樣濃度的增加而增加，但相差不大；隨著上樣液黃酮濃度的提高，當(dāng)超過1.736 mg/ml時(shí)吸附率有明顯降低。因此，上樣溶液中黃酮的濃度以1.4491.736 mg

15、/ml左右為宜。2.4.2 最佳吸附流速的確定將黃酮濃度為1.728 mg/ml補(bǔ)骨脂樣品液10 ml通過LSA-21樹脂柱，分別控制流速為0.5，1，2，4 ml/min進(jìn)行吸附。然后用等量去離子水清洗樹脂床中未被吸附的成分，一并收集為流出液。測(cè)定并計(jì)算流出液的濃度，計(jì)算黃酮吸附率，確定最佳吸附流速。結(jié)果見圖 2。    吸附流速越慢被吸附物質(zhì)越能和樹脂充分接觸，從而能更好地吸附在樹脂上，但是工作效率會(huì)大大下降。流速越快，被吸附物質(zhì)來不及擴(kuò)散到樹脂表面就會(huì)發(fā)生泄漏。從圖2可以看出，隨著流速增大吸附率會(huì)下降，在0.5 ml/min和1 ml/min流速下進(jìn)行吸附時(shí)

16、，吸附率均超過90%且相差不大，所以綜合考慮吸附效果和工作效率，確定吸附流速采用1 ml/min。2.4.3 泄漏曲線的繪制將6 g LSA-21樹脂濕法裝柱，一個(gè)柱床體積為10 ml。取濃度為1.728 mg/ml的樣品溶液于柱頂，以1 ml/min的流速上樣，每10 ml收集一個(gè)流分，測(cè)定并計(jì)算每份收集液中黃酮濃度，繪制泄漏曲線。結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，上樣量在10倍柱床體積后，泄漏量已經(jīng)基本不變，樹脂達(dá)到吸附平衡；上樣量為1倍柱床體積時(shí)基本無泄漏，當(dāng)上樣量為2倍柱床體積時(shí)泄漏量明顯上升，所以樹脂載樣量為1倍柱床體積。2.4.4 洗脫劑濃度的確定按上述確定的吸附條件進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附后，用等

17、量去離子水洗去未吸附成分，再分別用等量不同濃度的乙醇溶液以相同流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測(cè)定并計(jì)算洗脫液中黃酮含量，計(jì)算黃酮解吸率。結(jié)果見圖4。    從圖4可以明顯看出用90%乙醇洗脫效果最佳，解吸率超過90%，所以確定最佳洗脫劑為90%乙醇。2.4.5 最佳洗脫流速的確定按上述確定的吸附條件進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附后，用去等量離子水洗去未吸附成分，再分別用等量濃度為90%的乙醇溶液以0.5，1，2，4 ml/min流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測(cè)定并計(jì)算洗脫液中黃酮含量，計(jì)算解吸率。結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，隨著洗脫流速的增大解吸率會(huì)下降，在0.5 ml/min和1 ml/

18、min流速下進(jìn)行洗脫時(shí)，解吸率均超過90%且相差不大，2 ml/min流速下洗脫時(shí)解吸率下降明顯，所以綜合考慮解吸效果和工作效率，確定洗脫流速為1 ml/min。2.4.6 洗脫曲線的繪制按上述確定的吸附條件進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附后，用等量去離子水洗去未吸附成分，取90%乙醇于柱頂，以1 ml/min的流速進(jìn)行洗脫，每10 ml（一個(gè)柱床體積）收集一個(gè)流分，測(cè)定并計(jì)算每份收集液中黃酮濃度，繪制洗脫曲線。結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，當(dāng)洗脫液體積在8倍柱床體積后洗脫液濃度明顯降低且黃酮含量極低，可認(rèn)為樹脂上吸附的黃酮已經(jīng)基本洗脫完全，所以洗脫劑用量確定為8倍柱床體積。3 討論本實(shí)驗(yàn)通過靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附解吸篩選

19、，考查了XDA-1，SP825，LSA-21，D101，AB-8，LSA-30，D4020樹脂對(duì)補(bǔ)骨脂黃酮的吸附與解吸能力。綜合靜態(tài)和動(dòng)態(tài)篩選并進(jìn)行比較，確定吸附能力和解吸能力都較好的LSA-21樹脂為分離純化補(bǔ)骨脂黃酮物質(zhì)的最佳樹脂。所以選定LSA-21大孔樹脂為主要研究對(duì)象。    本實(shí)驗(yàn)利用大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附解吸，對(duì)LSA-21大孔吸附樹脂分離純化補(bǔ)骨脂黃酮的工藝條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明，最佳工藝條件為:濃度為1.4491.736 mg/ml補(bǔ)骨脂黃酮上樣液，以1 ml/min的流速上樣，再用8倍柱床體積、90%的乙醇，以1 ml/min流速進(jìn)行洗脫。以此工藝條件分離純化補(bǔ)骨脂黃酮效果最佳且效率最高。    本實(shí)驗(yàn)使用