復(fù)方中藥丹星通絡(luò)湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

1、    復(fù)方中藥丹星通絡(luò)湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用            作者：馬春華,穆春曉,劉耘時(shí)間：2007-11-22 11:28:00                     【關(guān)鍵詞】  復(fù)方丹星通絡(luò)湯；

2、腦缺血;再灌注損傷;乳酸脫氫酶；FAS    【Abstract】 AIM: To study the neuroprotection and mechanism of danxingtongluotang （DX） on rats with focal cerebral ischemiareperfusion (I/R) injury. METHODS: Forty SD male rats were divided randomly into 4 groups: control group, shamoperated + normal saline (NS);

3、 model group, cerebral I/R+NS; nimodipine group, I/R+nimodipine; DX group, I/R+DX. The 4 groups were fed with NS, nimodipine or DX for consecutive 5 d. Focal I/R models were made with sutureocclusion method. After cerebral ischemia for 2 h and then reperfusion for 24 h, the activity of LDH in serum

4、was measured and the expression of FAS in brain tissue was detected. RESULTS: After cerebral I/R, the activity of LDH in serum of model group increased significantly as compared with control group (P<0.05); the activity of LDH in nimodipine group and DX group decreased obviously and was lower tha

5、n that in model group （P<0.05, P<0.01）, there was no significant difference between the activity of nimodipine group and DX group (P>0.05). Expression of FAS in brain tissue of model group  increased significantly as compared with that in control, nimodipine and DX groups (P<0.01);

6、the expression of  FAS in brain tissue of nimodipine and DX groups  was decreased significantly as compared with that in model group（P<0.01）; the level of DX group was lower than that of nimodipine group. CONCLUSION: DX has an obvious protection against I/R injury probably through decre

7、asing the activity of LDH and the expression of FAS in brain tissue.    【Keywords】 danxingtongluotang; cerebral ischemia; reperfusion injury; LDH；  FAS    【摘要】 目的: 探討復(fù)方中藥丹星通絡(luò)湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制. 方法: 40只大鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組(假手術(shù)+生理鹽水)、模型組(缺血再灌注+生理鹽水)、尼莫地平組(缺血再灌注+尼莫地平)、

8、復(fù)方丹星通絡(luò)湯組(缺血再灌注+復(fù)方丹星通絡(luò)湯). 每組分別連續(xù)5 d灌胃口服生理鹽水、尼莫地平、復(fù)方丹星通絡(luò)湯. 線栓法制作局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2 h后再灌注24 h. 檢測(cè)血清乳酸脫氫酶（LDH）活力、大腦FAS細(xì)胞表達(dá). 結(jié)果:模型組大鼠局灶性腦缺血再灌注后血清LDH活力明顯高于對(duì)照組（P<0.05）, 尼莫地平組、復(fù)方丹星通絡(luò)湯組血清中LDH活力明顯降低（尼莫地平組vs 模型組，P<0.01； 復(fù)方丹星通絡(luò)湯組vs模型組，P<0.05），尼莫地平組和復(fù)方丹星通絡(luò)湯組間無(wú)顯著性差異（P>0.05）. 模型組大腦FAS細(xì)胞表達(dá)明顯高于對(duì)照，尼莫地平，復(fù)方丹星通

9、絡(luò)湯組（P<0.01）,與模型組比較，尼莫地平組、復(fù)方丹星通絡(luò)湯組腦組織FAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）,復(fù)方丹星通絡(luò)湯組明顯低于尼莫地平組（P<0.01）. 結(jié)論: 復(fù)方丹星通絡(luò)湯可有效地防止FAS及LDH升高, 對(duì)腦缺血再灌注腦損傷有顯著保護(hù)作用.    【關(guān)鍵詞】 復(fù)方丹星通絡(luò)湯；腦缺血;再灌注損傷;乳酸脫氫酶；FAS      0引言    復(fù)方中藥丹星通絡(luò)湯是在清熱化痰、活血通絡(luò)治療中風(fēng)病的理論基礎(chǔ)上，化裁精簡(jiǎn)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、膽南星、三七等

10、藥組成. 我們觀察了該藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠局灶性腦缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用，并初步分析了其作用機(jī)制, 為臨床防治中風(fēng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).    1材料和方法    1.1材料復(fù)方丹星通絡(luò)湯生藥由大連醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥局代購(gòu)，常規(guī)水煎，濃縮至1 kg/L（生藥量）的溶液備用. 尼莫地平片（山西亞寶藥業(yè)有限公司）；FAS（NEO MARKERS公司），稀釋度為1150；Sp即用型工作試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);多聚甲醛（天津市化學(xué)試劑廠）. 721分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；802離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；微量天平：北

11、京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司；熒光顯微鏡BX51：日本Olympus；數(shù)碼相機(jī)cool PI995:日本Nikon；超薄切片機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；SHZ300多用途水浴恒溫箱（江蘇太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠）. 40 g/L多聚甲醛固定液：900 mL蒸餾水中加入Na2HPO412H2O 36 g，多聚甲醛40 g，加熱攪拌（勿使其沸騰）,待其完全溶解后加入Na2HPO42H2O 3 g，定容至1000 mL；PBS：900 mL蒸餾水中加入NaCl 9 g，Na2HPO412H2O 6 g，Na2HPO42H2O 0.4 g，定容至1000 mL；DAB顯色劑：臨用先配. 6 mg DAB粉末加入10 m

12、L PBS，充分研磨后，加入30 mL/L H2O 230 L混勻，避光.    1.2方法SD大鼠體質(zhì)量約200250 g，雄性，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. 大鼠40只隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、模型組、尼莫地平組及丹星通絡(luò)湯組. 對(duì)照組和模型組分別灌胃生理鹽水20 mL/kg，尼莫地平組20 mL/kg灌胃（濃度1 g/L），丹星通絡(luò)湯組灌胃復(fù)方丹星通絡(luò)湯7.5 mL/kg.  連續(xù)灌胃5 d，最后灌胃2 h后線栓法造模，用100 mL/L水合氯醛(3 mLkg)腹腔麻醉，取仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上行右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷術(shù)(MCAO)，頸部正中切開(kāi)，分離

13、出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈及翼顎動(dòng)脈. 先結(jié)扎翼顎動(dòng)脈的近心端，防止魚(yú)線插入翼顎動(dòng)脈，然后在頸總動(dòng)脈前壁剪一小口，插入魚(yú)線，經(jīng)頸總動(dòng)脈穿入頸內(nèi)動(dòng)脈，繼續(xù)向前推進(jìn)直到感覺(jué)有輕微阻力，提示尼龍線的頭部已經(jīng)達(dá)到了頸內(nèi)動(dòng)脈的分叉處,即大腦中動(dòng)脈的起始部. 頸總動(dòng)脈分叉處切口，插入直徑0.22 mm魚(yú)線，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，深度為1720 cm，至大腦前動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈所有的血流來(lái)源. 扎緊備線，外留1 cm長(zhǎng)線頭，縫合皮膚. 缺血2 h后再灌注，勿需再次麻醉和切開(kāi)皮膚，輕輕提拉所留線頭至阻力時(shí)提示魚(yú)線頭端已至頸總動(dòng)脈切口處，血液再通，再灌注24 h. 再灌前參照Longa等方法進(jìn)行5 分制神

14、經(jīng)功能評(píng)分(0分:無(wú)明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分:不能完全伸展左前肢；2分:向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分:向左側(cè)傾倒；4分:不能自行行走). 評(píng)分為13分者模型制備成功，余者剔除. 不足預(yù)定數(shù)額者按照隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物并重新造模. 對(duì)照組栓線不插入頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段， 其余同以上.    血清中LDH活力的測(cè)定：腦缺血、再灌注模型再灌24 h，腹主動(dòng)脈取血5 mL，高速離心機(jī)離心取上清液2 mL，編號(hào),24冷藏，制備血清標(biāo)本；將備好的血清用分光光度劑測(cè)定測(cè)定管A值、測(cè)空管A值、標(biāo)空管A值、標(biāo)準(zhǔn)管A值，利用公式，計(jì)算血清中LDH活力. 血清中LDH活力=（測(cè)定管A值-測(cè)空管A值）/（標(biāo)

15、準(zhǔn)管A值-標(biāo)空管A值）×2000,標(biāo)準(zhǔn)管A值=0.1899,  標(biāo)空管A值=0.085,   測(cè)空管A值=0.12.    大鼠腦組織FAS的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分析：將各組大鼠深度麻醉，迅速打開(kāi)胸腔，左心室插管經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水200 mL，再持續(xù)灌注0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的40 g/L多聚甲醛固定液300 mL，斷頭取腦，再用相同固定液后固定1 h，制備腦組織； 石蠟包埋、切片、防脫片處理；分別取與HE染色相鄰的切片進(jìn)行FAS免疫組化檢測(cè)：免疫組化采用SP法，DAB顯色；結(jié)果評(píng)定：用光學(xué)顯微鏡（×400），觀察每個(gè)視野中FAS蛋白表達(dá)數(shù)目（胞質(zhì)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞），