基于脾虛證相關(guān)基因功能鑒定的小腸上皮細(xì)胞RNA干擾轉(zhuǎn)染條件研究

1、基于脾虛證相關(guān)基因功能鑒定的小腸上皮細(xì)胞RNA干擾轉(zhuǎn)染條件研究         11-02-27 10:19:00     編輯：studa20                 作者：王靜，李茹柳，郭文峰，徐頌芬，羊燕群，高小玲，陳蔚文 【摘要】  【目的】探索影響大鼠小腸上皮細(xì)胞(IEC6)RNA

2、干擾效率的轉(zhuǎn)染條件，為進(jìn)一步以RNA干擾(RNAi)技術(shù)構(gòu)建不同程度表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞模型打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳?4孔培養(yǎng)板培養(yǎng)IEC6細(xì)胞，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FAMsiRNA片段進(jìn)入IEC6細(xì)胞，采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)FAMsiRNA和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000不同劑量比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響?！窘Y(jié)果】(1)采用熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，以評(píng)分進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，結(jié)果僅有轉(zhuǎn)染試劑或僅有FAMsiRNA或兩者均無的組別評(píng)分均為0，轉(zhuǎn)染試劑加FAMsiRNA組別均有或強(qiáng)或弱的熒光表達(dá)。(2)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，以Lipofectamine 2000 10 L+ FAMsiRN

3、A 160 nmol/L組轉(zhuǎn)染效率最高(平均763%)，而空白對(duì)照組約為1%?！窘Y(jié)論】FAMsiRNA 160 nmol/L(20 mol/L、48 L，終體積為06 mL)+ Lipofectamine 2000 10 L組合為IEC6細(xì)胞RNA干擾時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高的轉(zhuǎn)染條件。 【關(guān)鍵詞】  基因功能;RNA干擾;細(xì)胞培養(yǎng)RNA干擾(RNA interference，RNAi)是真核生物中普遍存在的一種自然現(xiàn)象，是由雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)啟動(dòng)序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，是生物體在進(jìn)化中形成的一種內(nèi)在基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。Fire等1首次在線蟲

4、中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象，后來大量的研究表明，RNAi廣泛存在于真菌、植物和動(dòng)物中，由此人們認(rèn)識(shí)到RNAi技術(shù)作為研究基因功能的一種有力的革命性工具，在功能基因組、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究、基因治療、藥物開發(fā)等方面有著巨大的潛力2-3。目前RNA干擾技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已成為研究基因功能最常用的技術(shù)之一。影響RNA干擾效率的主要因素是小型干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)的序列及轉(zhuǎn)染效率，而控制不同的干擾效率可建立模擬靶蛋白不同表達(dá)水平的細(xì)胞模型。因此，對(duì)轉(zhuǎn)染條件的控制有利于獲得對(duì)目的蛋白表達(dá)不同干擾程度的細(xì)胞模型。而影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵是轉(zhuǎn)染試劑和siRNA的比例，但不同種類的細(xì)胞該

5、比例是不同的。小腸上皮細(xì)胞6(IEC6)細(xì)胞株是Quaroni等4研究建立的，其來源于新生的正常大鼠小腸，在組織學(xué)和免疫學(xué)方面具有隱窩樣上皮細(xì)胞的特征，為未分化的上皮干細(xì)胞，無特異性基因表達(dá)及無致瘤性。目前將RNAi技術(shù)應(yīng)用到腸上皮細(xì)胞的研究國(guó)內(nèi)較少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室近年來以IEC6細(xì)胞株用于消化系統(tǒng)疾病的體外相關(guān)研究5-7。為在該細(xì)胞上開展RNAi的脾氣虛證相關(guān)基因的功能研究，本實(shí)驗(yàn)采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率的方法，優(yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入IEC6細(xì)胞的條件，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法11細(xì)胞株IEC6細(xì)胞株(CRL1592)購(gòu)自The American

6、Type Culture Collection(ATCC)，LOT：4785615。12主要試劑與儀器Dulbeccos Modified Eagle Medium(DMEM)、Fetal Bovine Serum(FBS)均為GIBCO公司產(chǎn)品，胰酶Trypsin(1250)為Amresco產(chǎn)品，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA2Na·2H2O，分子量37224)由廣州威佳科技有限公司提供，Albumin及Bovine為Genebase產(chǎn)品，牛胰島素(insulin)為Sigma產(chǎn)品，Ncontrol05815FAM(No.2005815122174)購(gòu)自廣州市瑞博生物科技有限公司，轉(zhuǎn)染

7、試劑LipofectamineTM2000(Cat.No.11668027)、OptiMEM(Cat.No.31985062)均由Invitrogen公司提供。IX71型相差熒光倒置顯微鏡為Olypums公司產(chǎn)品，ALTRA EPICS型流式細(xì)胞儀為貝克曼爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司廣州分公司產(chǎn)品。13細(xì)胞培養(yǎng)取液氮保存的IEC6細(xì)胞37水浴使其迅速融化后，將凍存液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，3000 r/min離心5 min，去上清液，加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)90%DMEM+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清+4 mmol/L L谷氨酰氨+01 U/mL牛胰島素+10 mmol/L HEPES)重

8、新懸浮沉淀的細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶，體積分?jǐn)?shù)10%CO2、90%空氣，飽和濕度下37°C培養(yǎng)，次日換液。至80%左右融合時(shí)，用25 g/L胰酶053 mmol/L EDTA消化傳代。14種植細(xì)胞待培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)IEC6細(xì)胞生長(zhǎng)至80%90%時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，制作單細(xì)胞混懸液，按1×105 cells/mL，每孔1 mL密度種植到24孔培養(yǎng)板上，以保證第2天生長(zhǎng)至60%。15轉(zhuǎn)染siRNA片段以定量的OptiMEM稀釋Lipofectamine 2000，用加樣槍輕輕混勻后，室溫下孵育5 min(a液)。用定量的OptiMEM稀釋FAMsiRNA，用加樣槍輕輕混勻(b液)。將a液與b液

9、充分混勻，室溫下孵育20 min(c液)。將c液加到合適的細(xì)胞培養(yǎng)板中，另外每孔加入05 mL不含血清的培養(yǎng)基，輕輕搖晃培養(yǎng)板以混勻，然后在37 、體積分?jǐn)?shù)10%CO2條件下孵育細(xì)胞，5 h后更換為含體積分?jǐn)?shù)10%血清的完全培養(yǎng)基，再放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。16熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率設(shè)置FAMsiRNA(A)0、40、80、160 nmol/L組，同時(shí)Lipofectamine 2000(B)設(shè)0、10、15、20 L劑量，每組3個(gè)復(fù)孔，共48孔。轉(zhuǎn)染12 h后熒光倒置顯微鏡下成像，每孔選擇3個(gè)視野，每個(gè)視野分別于明場(chǎng)和熒光條件下成像1張，每孔選擇1張熒光表達(dá)強(qiáng)度最強(qiáng)的照片進(jìn)行評(píng)分8。0分：幾乎或

10、完全沒有熒光。1分：有微弱熒光表達(dá)且表達(dá)不密集。3分：熒光表達(dá)強(qiáng)烈且密集。2分：介于1分和3分之間，有較強(qiáng)熒光表達(dá)但不集中或者有微弱熒光表達(dá)但較密集(圖1，見彩圖頁(yè)第616頁(yè))。經(jīng)9人次評(píng)分后計(jì)算平均分值并作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。17流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率根據(jù)熒光顯微鏡成像評(píng)分結(jié)果設(shè)置不同組別，每組3個(gè)復(fù)孔。24 h內(nèi)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞2次，每孔加入05 mL消化液，孵育2 min后，加入等量完全培養(yǎng)基終止消化，混勻，離心，棄上清，PBS重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞至同一密度，在激發(fā)波488 nm，發(fā)射波525 nm上機(jī)檢測(cè)。18統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 110統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)熒光顯微鏡檢測(cè)熒光

11、強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣本等級(jí)資料統(tǒng)計(jì)分析(Kruskal Wallis H)。2結(jié)果21細(xì)胞培養(yǎng)IEC6細(xì)胞接種后次日開始緩慢生長(zhǎng)，之后生長(zhǎng)速度急劇加快。若按13分瓶傳代，一般5 d后即可達(dá)80%融合。圖2可見IEC6細(xì)胞由均勻的上皮樣細(xì)胞群組成，呈鋪路石鑲嵌排列，互不重疊，呈現(xiàn)典型的單層形態(tài)。細(xì)胞為不規(guī)則多角形，邊界清楚。細(xì)胞核較大，呈卵圓形，細(xì)胞間互相連接，呈現(xiàn)旺盛的增殖活性。圖2相差倒置顯微鏡下IEC6細(xì)胞形態(tài)Figure 2Histological features of IEC6 under phasecontrast inverted microscope22熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率評(píng)分后

12、，若僅有轉(zhuǎn)染試劑或僅有FAMsiRNA，或兩者均無的組別評(píng)分均為0。而轉(zhuǎn)染試劑加FAMsiRNA組別均有或強(qiáng)或弱的熒光表達(dá)，其中熒光表達(dá)強(qiáng)度最弱的是Lipofectamine 2000 10 L+ FAMsiRNA 40 nmol/L和Lipofectamine 2000 20 L+FAMsiRNA 40 nmol/L。在FAMsiRNA 160 nmol/L不變、轉(zhuǎn)染試劑改變(10、15、20 L)時(shí)，3組熒光表達(dá)強(qiáng)度比較，差異無顯著性意義(P>005)。在FAMsiRNA 80 nmol/L不變、轉(zhuǎn)染試劑改變(10、15、20 L)時(shí)，3組熒光表達(dá)強(qiáng)度比較，差異無顯著性意義(P>

13、;005)。在FAMsiRNA 40 nmol/L不變、轉(zhuǎn)染試劑改變(10、15、20 L)時(shí)，3組熒光表達(dá)強(qiáng)度比較，差異無顯著性意義(P>005)。在轉(zhuǎn)染試劑10 L不變、FAMsiRNA改變(40、80、160 nmol/L)的情況下，3組熒光表達(dá)強(qiáng)度比較，以80 nmol/L組表達(dá)較強(qiáng)，差異有顯著性意義(P<005)。在轉(zhuǎn)染試劑15 L不變、FAMsiRNA改變(40、80、160 nmol/L)時(shí)，3組熒光表達(dá)強(qiáng)度比較，差異無顯著性意義(P>005)。在轉(zhuǎn)染試劑20 L不變、FAMsiRNA改變(40、80、160 nmol/L)時(shí)，3組熒光表達(dá)強(qiáng)度比較，以80 nm

14、ol/L和160 nmol/L組表達(dá)較強(qiáng)，差異有顯著性意義(P<005)。結(jié)果見表1。23流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率結(jié)果見圖3和表2。在無FAMsiRNA時(shí)，只有1%左右的表達(dá)率(圖3-a)。轉(zhuǎn)染試劑在10 L 時(shí)，表達(dá)效率要高于15 L (圖3-b、c、d、e)，尤以Lipofectamine 2000 10 L+ FAMsiRNA 160 nmol/L組最高(圖3-e)，平均達(dá)到763%。表1各組熒光強(qiáng)度評(píng)分平均秩和值表2流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染效率3討論本課題組前期收集了慢性胃炎脾氣虛證患者及健康志愿者各4例，鏡下取胃黏膜組織，提取總RNA，一一配對(duì)制作基因芯片，采用熒光比值、生物信息學(xué)

15、、雙側(cè)t檢驗(yàn)等方法比較分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因54條，722%下調(diào)，其中與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)差異表達(dá)基因45條，711%下調(diào)，差異基因中有4條基因?yàn)轱@著差異表達(dá)基因(P<005)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)差異基因5條，4條與芯片結(jié)果一致：其中核糖體蛋白S20(ribosomal protein S20，RPS20)、ACAA2(acetylcoenzyme A acyhransferase 2，脂類/脂肪酸代謝)為下調(diào)，精胺合酶(spermine synthase，SMS)、肌球蛋白(myosin，heavy chain 9，nonmuscle，MYH9)為上調(diào)。1條不符合，核糖體蛋白35(ribosomal protein L35，RPL35)在芯片為下調(diào)，在PCR為上調(diào)。研究最后獲得脾氣虛患者4條明確與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)的基因9。為了進(jìn)一步從分子水平闡述脾虛證的本質(zhì)，我們擬采用RNAi