一種人硫氧還蛋白基因修飾肝細胞的制備

1、一種人硫氧還蛋白基因修飾肝細胞的制備 作者：李華， 汪根樹， 張劍， 姜楠， 賈昌昌， 楊揚， 陳規(guī)劃【摘要】 【目的】 制備出一種人硫氧還蛋白(hTrx)基因修飾的肝細胞。 【方法】 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法擴增出hTrx cDNA，應(yīng)用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒制備hTrx基因修飾大鼠肝細胞。白蛋白免疫組化SABC法進行肝細胞活性鑒定，MTT比色試驗進行抗氧化應(yīng)激能力檢測。【結(jié)果】 克隆出hTrx開放閱讀框cDNA并制備出重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染真核細胞后可分泌融合表達的hTrx并具有生物學(xué)活性。制備出hTrx基因修飾大鼠肝細胞，免疫組化SABC法顯示肝細胞功能正常，MTT比色法檢測具有較強的抗氧化應(yīng)激能力(

2、P 0.05)，并可有效增殖?！窘Y(jié)論】 成功制備出一種具有較強抗氧化應(yīng)激的hTrx基因修飾肝細胞。 【關(guān)鍵詞】 肝細胞; 人硫氧還蛋白; 基因修飾Abstract： 【Objective】 To prepare the human thioredoxin (hTrx) gene-modified hepatocytes. 【Methods】 hTrx cDNA was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)， recombinant retrovirus was applied to prima

3、ry cultured rat hepatocyte for infection to generate hTrx gene-modified rat hepatocytes， whose viability and antioxidative capacity were examined with albumin-immunohistochemical staining and MTT assay， respectively. 【Results】 The hTrx open reading frames cDNA was cloned and assembled with recombina

4、nt retrovirus， then eukaryotic cells infected by this virus were capable of expressing bioactive hTrx in the form of fusion proteins. Immunohistochemistry demonstrated normal function of the hTrx gene-modified hepatocytes， which possessed strong antioxidative capacity as shown by MTT assay and could

5、 be proliferated effectively. 【Conclusion】 The hTrx gene-modified hepatocyte with more stronger antioxidative capacity is prepared.人硫氧還蛋白(human thioredoxin， hTrx)是目前已知Trx中活性最好的蛋白，由TrX構(gòu)成的氧化還原系統(tǒng)廣泛存在于組織細胞中，具有清除自由基和維持體內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)的重要作用，對缺血再灌注損傷有明確的保護作用。Trx也可通過對轉(zhuǎn)錄因子如NF-B等的調(diào)節(jié)作用，促進細胞的增殖及抑制細胞的凋亡等1-2。研究發(fā)現(xiàn)Trx對肝

6、細胞生存生長具有明顯的促進作用3，同時其抗氧化和凋亡抑制作用，因此可在肝細胞移植和生物人工肝細胞保存方面發(fā)揮重要作用。但能否持久地促進肝細胞的增殖，減少凋亡和氧化應(yīng)激成為Trx應(yīng)用的關(guān)鍵。本實驗成功進行了hTrx基因修飾肝細胞的制備，修飾后的肝細胞表現(xiàn)出較強的抗氧化應(yīng)激能力，可緩解細胞損傷等。1 材料和方法1.1 hTrx cDNA基因克隆根據(jù)GenBank中hTrx cDNA 序列(J04026)設(shè)計引物，引入Bgl、BamH酶切位點，并加入對框序列TT(不含終止子TAA)。引物：正向5- GCAGATCTATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3，反向5-GCGGATCCTTGACTAA

7、TTCATTAATGGTGGCTT C-3。異硫氰酸胍一步法從143(TK-)人骨肉瘤細胞中提取模板RNA。應(yīng)用錨定引物oligo(dT) 15逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增hTrx cDNA基因，插入載體質(zhì)粒pGEM-T Easy構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM/hTrx，并進行基因序列測定。質(zhì)粒的制備、純化、酶切、連接及轉(zhuǎn)化按常規(guī)方法進行。1.2 含hTrx基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建大量制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1(購自Clontech公司)，將其和pGEM/hTrx分別行Bgl、BamH聯(lián)合酶切、回收、連接。篩選鑒定含hTrx基因的重組質(zhì)粒pLEGFP/hTrx。

8、1.3 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備運用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法進行重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備。取pLEGFP/hTrx，電泳定量約1 g/L。加入2.5 mol/L CaCl2，加至復(fù)蘇的PA317細胞(胚胎成纖維細胞)表面，可見細密沉淀鈣粒形成。37 下CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8 h，加入含100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37 培養(yǎng)箱內(nèi)72 h。2.5 g/L胰酶消化后按1：3傳代，質(zhì)量濃度為400 g/mL的G418(一種氨基糖苷類抗生素)篩選高表達細胞株。14 d時有多個抗性克隆形成，細胞克隆單瓶培養(yǎng)至抗性細胞形成單層，消化傳代后，加入DMEM培養(yǎng)液(不含G418)培養(yǎng);收集細胞上清液進行病毒濃縮純

9、化。加入預(yù)冷飽和硫酸銨， 透析純化濃縮，經(jīng)0.22 m微孔濾膜除菌處理。1.4 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測定復(fù)蘇NIH3T3細胞(小鼠胚胎成纖維樣細胞)，鋪滿培養(yǎng)瓶后，2.5 g/L胰酶消化，培養(yǎng)接種于24孔培養(yǎng)板。將制備的多組病毒液均相應(yīng)作104、105和106倍稀釋接種在細胞表面;37 ，5%體積分數(shù)CO2條件下培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察每孔含熒光的細胞數(shù)，計算病毒滴度，選擇最高滴度的病毒液為實驗用重組病毒。重組質(zhì)粒含EGFP，與目的基因表達的蛋白融合，熒光顯微鏡下顯現(xiàn)綠色熒光，較好地反映重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的形成情況及感染活性。1.5 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞后hTrx表達和活性測定用胰島素還原實

10、驗進行重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞后hTrx表達和活性測定。取重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液，接種于NIH3T3細胞表面。37 ，5%體積分數(shù)CO2條件培養(yǎng)后取上清液，取不同體積(25 L、50 L、100 L)上述標本，加入實驗用Buffer，30 反應(yīng)，檢測波長為650 nm時的吸光度。另取空質(zhì)粒pLEGFP-N1、DMEM培養(yǎng)基制備對照組，本實驗前期制備的hTrx作為標準品陽性對照(1 mol/L，2.5 mol/L，10 mol/L)2。比較各組酶反應(yīng)速度(某一濃度的酶在達到最大吸光度值時與所用最小時間之間的比值，用以反映該酶反應(yīng)的活性)。1.6 hTrx基因修飾大鼠肝細胞的制備原代SD大鼠肝細胞的培養(yǎng)方

11、法同前所述2。將分離的大鼠肝細胞按1 106細胞/mL接種于涂有多聚賴氨酸培養(yǎng)瓶中，加入含100 mL/L小牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入重組逆轉(zhuǎn)錄病毒原液及8 g/mL polybrene(凝聚胺)作用3 h;重復(fù)感染一次，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，至培養(yǎng)肝細胞80%成片，以400 g/mL G418篩選肝細胞抗性克隆并生長穩(wěn)定成片，熒光顯微鏡下觀察肝細胞中熒光蛋白表達情況?？召|(zhì)粒pLEGFP-N1制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒制備對照組肝細胞。1.7 hTrx基因修飾大鼠肝細胞活性鑒定白蛋白免疫組化SABC法進行肝細胞活性鑒定。將制備的病毒感染肝細胞以2.5 g/L胰酶消化后接種于蓋玻片上，37 ，5%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)4 h使細胞貼壁緊密，丙酮固定。一抗兔抗鼠白蛋白單克隆抗體(1 200)，二抗生物素化HRP-山羊抗兔單克隆抗體IgG(1 4000)。DAB顯色，以細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。正常大鼠原代培養(yǎng)肝細胞作為陽性對照。1.8 hTrx基因修飾大鼠肝細胞抗氧化應(yīng)激能力檢測MTT比色試驗進行抗氧化應(yīng)激能力檢測。將肝細胞(hTrx基因修飾大鼠肝細胞、空質(zhì)粒pLEGFP-N1轉(zhuǎn)染病毒感染肝細胞及正常大鼠肝細胞)制成單細胞懸液，以每孔100 L，細胞數(shù)104接種于96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至細胞80%成片，加入實驗濃