細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)講義

1、實(shí)驗(yàn)一 細(xì)胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察實(shí)驗(yàn)原理與目的 （1） 通過(guò)觀察動(dòng)、植物細(xì)胞，了解細(xì)胞形態(tài)的多樣性并掌握光鏡下細(xì)胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。（2） 初步掌握臨時(shí)制片技術(shù)和顯微繪圖的方法。 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位。構(gòu)成人體或其他高等動(dòng)物或植物的細(xì)胞種類繁多，形態(tài)各異。細(xì)胞的形態(tài)都與它們的功能相適應(yīng)。如具有運(yùn)輸O2和CO2功能的紅細(xì)胞為雙凹盤狀；具有感受刺激與傳導(dǎo)功能的神經(jīng)細(xì)胞呈星芒形，附有長(zhǎng)短不等的樹(shù)枝狀突起；上皮細(xì)胞是柱形或扁平形；巨噬細(xì)胞則呈不規(guī)則形狀，并能伸出偽足，以利于為執(zhí)行吞噬和消滅外源的病原微生物的功能。雖然細(xì)胞在形態(tài)上多種多樣、大小不同，但卻具有共同的基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，

2、即都是由細(xì)胞膜（cell membrane）、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)和細(xì)胞核(nucleus)組成。實(shí)驗(yàn)用品1器具：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、推片、吸管、鑷子、牙簽、擦鏡紙、吸水紙、小剪刀。2材料：洋蔥、人口腔上皮細(xì)胞、雞血液、人血細(xì)胞涂片、蟾蜍血細(xì)胞涂片。3試劑：2 %碘液、Giemsa 染液。試劑配制12 %碘液：稱取碘片2g，碘化鉀5g，蒸餾水100ml 混勻溶解即可。2吉姆薩(Giemsa) 染液：吉姆薩粉(Giemsa stain) l.0g 甘油(AR) 66ml 甲醇(AR) 66ml 將Giemsa粉放入研缽中，先加入少量甘油，研磨至無(wú)顆粒為止，然后再將全部甘油倒入，放56

3、溫箱中2h后，加入甲醇，將配制好的染液密封保存棕色瓶?jī)?nèi)(最好于04保存)。內(nèi)容與方法一、洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞制片與觀察：1. 臨時(shí)制片：取一擦凈的載玻片，在玻片中央滴一滴2%的碘液，將洋蔥莖用小刀分為幾塊，取一塊肉質(zhì)鱗葉，用鑷子在其表面輕輕撕下一小塊膜質(zhì)表皮，再用剪刀剪成34mm2的小塊，置于載玻片的染液中鋪平，染色23分鐘，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去蓋玻片周圍多余的染液。2. 觀察：將標(biāo)本置于低倍鏡下觀察，可見(jiàn)許多長(zhǎng)柱狀排列整齊、彼此相連的細(xì)胞，選擇其中較典型的細(xì)胞移至視野中央，然后換成高倍鏡觀察以下結(jié)構(gòu)： 1）細(xì)胞壁：在每?jī)蓚€(gè)細(xì)胞相連處，可看到二層壁狀結(jié)構(gòu)，是相鄰細(xì)胞各自的細(xì)胞壁，有纖維素構(gòu)成。

4、細(xì)胞膜緊貼在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)，不易看到。 2）細(xì)胞核：呈橢圓形，位于中央，被染成黃色，成熟的細(xì)胞由于液泡的擠壓，核位于質(zhì)膜邊緣。細(xì)胞核一般有12個(gè)折光較強(qiáng)并染成黃色的核仁。 （3）細(xì)胞質(zhì)：是細(xì)胞膜以內(nèi)，細(xì)胞核以外的物質(zhì)，染色較淺，有1至數(shù)個(gè)液泡及微細(xì)顆粒（圖1 - 1）。二、人口腔粘膜上皮細(xì)胞制片與觀察： 1.臨時(shí)制片：在一張擦凈的載玻片中央滴一滴2%的碘液，取一根牙簽，用其粗端在自己口腔中的臉頰上刮幾下，將其刮下的粘膜上皮細(xì)胞涂布在碘液中，染色23分鐘，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去蓋玻片周圍多余的染液。 色23分鐘，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去蓋玻片周圍多余的染液。 2. 觀察：將制好的玻片標(biāo)本置于低倍鏡

5、下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞被染成黃色，成群或分散存在。由于該細(xì)胞體積較小，著色較淡，觀察時(shí)應(yīng)稍降低視野中的亮度，選擇較分散且輪廓清楚的細(xì)胞移至視野中央，換成高倍鏡觀察以下結(jié)構(gòu)。1）細(xì)胞膜：是包圍在細(xì)胞最外層的膜狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈扁平不規(guī)則的類圓形，細(xì)胞膜有些地方出現(xiàn)皺褶。2）細(xì)胞核：圓形或橢圓形的細(xì)胞核呈深黃色位于細(xì)胞中央，核中有時(shí)可見(jiàn)一致密的結(jié)構(gòu)，即為核仁。3）細(xì)胞質(zhì)：是細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間染色較淺的物質(zhì)（圖1 2； 圖1-3）。2. 觀察：將已經(jīng)染好的血涂片標(biāo)本（肉眼可見(jiàn)血膜呈粉紅色）放置在低倍鏡下，檢查整個(gè)血涂片，選擇細(xì)胞均勻分布、較少重疊的區(qū)域，然后轉(zhuǎn)換高倍鏡下仔細(xì)觀察，在人的血涂片上紅細(xì)胞數(shù)目多、體

6、積小、呈圓餅狀，無(wú)細(xì)胞核（圖1-4），胞質(zhì)呈粉紅色；白細(xì)胞比例較小，尋找較困難，但胞體較大，細(xì)胞核明顯，形態(tài)多樣，呈蘭紫色。雞的血細(xì)胞、蛙的血細(xì)胞的形態(tài)與人類有很大不同，在雞或蛙血的紅細(xì)胞涂片中，可見(jiàn)紅細(xì)胞呈卵圓形，并且有橢圓形的細(xì)胞核（圖1-5）。圖1-4 人血紅細(xì)胞的形態(tài)? 圖1-5雞血紅細(xì)胞的形態(tài)作業(yè)與思考題1.繪制高倍鏡下洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞、人口腔黏膜上皮細(xì)胞圖，并注明各部分結(jié)構(gòu)的名稱。 2.生物繪圖的基本要求是什么？實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞大小的測(cè)量實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)顯微測(cè)量方法實(shí)驗(yàn)原理 應(yīng)用顯微鏡的成像原理，同時(shí)借助顯微鏡的鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺，兩尺配合使用，進(jìn)行測(cè)量和運(yùn)算，得出細(xì)胞的大小。(目鏡測(cè)

7、微尺測(cè)量倍率比照表)實(shí)驗(yàn)材料、用品材料：人口腔上皮細(xì)胞,雞血紅細(xì)胞、洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞。儀器(請(qǐng)參看儀器圖庫(kù))：測(cè)微尺、顯微鏡。物鏡測(cè)微尺 目鏡測(cè)微尺實(shí)驗(yàn)步驟(一) 測(cè)微尺的使用操作1. 卸下目鏡的上透鏡，將目鏡測(cè)微尺有刻度一面向下裝在目鏡鏡面上，再旋上目鏡的上透鏡。2. 將鏡臺(tái)測(cè)微尺有刻度一面朝上放在載物臺(tái)上夾好，使測(cè)微尺刻度位于視野中央。調(diào)焦至看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度。3. 小心移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺(如目鏡測(cè)微尺刻度模糊，可轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡上透鏡進(jìn)行調(diào)焦)，使兩尺左邊的"0"點(diǎn)一直線重合，然后由左向右找出兩尺另一次重復(fù)的直線(圖1-6)。4?記錄兩條重合線間目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微

8、尺的格數(shù)。按下式計(jì)算目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度等于多少m目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度/ m=鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)/目鏡測(cè)微尺的格數(shù)(二)花粉細(xì)胞的觀察測(cè)量1采集剛開(kāi)放或?qū)⒁_(kāi)放的成熟花朵；2.在載玻片滴12滴蒸餾水；3.用接種針將花粉分散于蒸餾水上，蓋上蓋玻片；4. 用測(cè)微尺測(cè)量花粉細(xì)胞大小，計(jì)算平均值。附：雞血細(xì)胞的觀察測(cè)量將已經(jīng)制備好的雞血涂片放在染色盤架上，滴數(shù)滴瑞氏-吉姆薩染液欲涂片上，靜置染色1分鐘，滴加等量1/15mol/L磷酸緩沖液，用牙簽輕輕攪拌混勻，再靜置染色510分鐘，最后用清水緩緩沖洗1分鐘，傾斜放置，涼干后進(jìn)行觀察測(cè)量。實(shí)驗(yàn)報(bào)告用測(cè)微尺測(cè)量不同材料各種細(xì)胞的大小后，制表格表示測(cè)量結(jié)果。注

9、意事項(xiàng)載物臺(tái)上物鏡測(cè)微尺刻度是用加拿大樹(shù)膠和圓形蓋玻片封合的。當(dāng)除去松柏油時(shí)，不宜使用過(guò)多的二甲苯，以避免蓋玻片下的樹(shù)膠溶解。取出目鏡測(cè)微尺，將目鏡放回鏡筒，用擦鏡紙擦去目鏡測(cè)微尺上的油膩和手印思考題分別計(jì)算不同物鏡放大倍數(shù)下測(cè)微尺的單位。實(shí)驗(yàn)三 植物細(xì)胞骨架的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握考馬斯亮藍(lán)R250 對(duì)植物細(xì)胞骨架染色的方法。2. 通過(guò)對(duì)洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞的處理，掌握植物細(xì)胞骨架的制備方法與顯微形態(tài)觀察。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞骨架(cytoskeleton)，是細(xì)胞內(nèi)以蛋白質(zhì)纖維為主要成分的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，根據(jù)蛋白質(zhì)纖維的直徑、組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同可分為微絲、微管和中等纖維。細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞的形態(tài)

10、結(jié)構(gòu)及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞分裂等有重要的作用。本試驗(yàn)采用去垢劑TritonX-100 的緩沖液處理植物材料時(shí)，可將細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和大部分蛋白質(zhì)抽提掉，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白卻被保存下來(lái)，后者用考馬斯亮藍(lán)R250 染色，在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。三、實(shí)驗(yàn)用品(一)材料 洋蔥（二）器材 顯微鏡、載玻片、滴管、擦鏡紙、PH 計(jì)（三）試劑1. 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4緩沖液（PB，PH7.3）50ml0.15mol/L NaCl雙蒸餾水加至1000ml2. PB0.2mol/L Na2HPO4 77ml

11、0.2mol/L NaH2PO4 23ml3. M-緩沖液咪唑(PH 6.7) 50mmol/LKCl 50mmol/LMgC120.5mmol/LEGTA 1mmol/LEDTA 0.1mmol/L巰基乙醇 1mmol/L甘油 4mmol/L用1mol/L HCl 調(diào)pH 至7.2。4. 1%的Triton X-100/M-緩沖液5. 0.2%考馬斯亮藍(lán)R250 染液甲醇 46.5ml冰醋酸 7ml蒸餾水 46.5ml6. 3%戊二醛- PB 溶液（PH7.3）四、實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)圖4-4取洋蔥內(nèi)皮1cm左右置于含PBS 液的載玻片上濕潤(rùn)后，吸去PBS加2 滴1%Triton X-100/M-緩沖

12、液，5min吸去緩沖液，加3%戊二醛-PB 溶液，固定30min加PBS 洗2 次，共3min加0.2%考馬斯亮藍(lán)R250 染色30min用PBS 洗2 次，共2min，吸干鏡檢并繪圖圖4-4 細(xì)胞骨架標(biāo)本制作過(guò)程五、實(shí)驗(yàn)建議1. 用去垢劑TritonX-100 的緩沖液處理材料時(shí)，應(yīng)控制在30min 左右。2. 每一次加液或染色后，應(yīng)用PBS 洗2 次，并用濾紙吸干。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告及作業(yè)1. 畫出實(shí)驗(yàn)所觀察到的細(xì)胞骨架圖，并注明放大倍數(shù)。2. 為什么用TritonX-100 的緩沖液處理材料？實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞中多糖和過(guò)氧化物酶的定位【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆诊@示細(xì)胞中多糖和過(guò)氧化物酶反應(yīng)的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)

13、原理】高碘酸雪夫試劑反應(yīng)，簡(jiǎn)稱PAS反應(yīng)。主要是利用高碘酸作為強(qiáng)氧化劑，這種強(qiáng)氧化劑能打開(kāi)C-C鍵，使多糖分子中的乙二醇變成乙二醛，氧化所得到的醛基與Schiff試劑反應(yīng)形成紫紅色化合物。顏色的深淺與糖類的多少有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色或棕色絡(luò)合物，根據(jù)藍(lán)色或棕色的出現(xiàn)來(lái)表示過(guò)氧化物酶的存在。 PAS反應(yīng)過(guò)程如下：過(guò)氧化物酶聯(lián)苯胺反應(yīng)過(guò)程如下： 【實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑】（一）儀器 顯微鏡、鑷子、染色缽、刀片、載玻片、蓋玻片、吸水紙等 （二）材料 馬鈴薯塊莖、洋蔥根尖或洋蔥鱗莖 （三）試劑 1高碘酸溶液： 高碘酸（HIO4·2H2O）0.4g，95%乙醇35ml，M/

14、5醋酸鈉溶液（2.72g醋酸鈉溶于100ml H2O）5ml， 蒸餾水10ml 2Schiff試劑（配法見(jiàn) Feulgen反應(yīng)） 3亞硫酸水溶液（配法見(jiàn) Feulgen反應(yīng)） 470%乙醇 5聯(lián)苯胺溶液： 在0.85%鹽水內(nèi)加入聯(lián)苯胺至飽和為止，臨用前加入20%體積的H2O2 ，每2ml加一滴。 60.1%鉬酸銨溶液： 稱取0.1g鉬酸銨溶于100ml 0.85%鹽水.【方法與步驟】.（一）細(xì)胞中多糖的測(cè)定：高碘酸雪夫（PAS）反應(yīng) 1把馬鈴薯塊莖用刀片徒手切成薄片。 2浸于高碘酸溶液515min 。 3移入70%乙醇中浸片刻。 4Schiff試劑染色15min 。 5亞硫酸溶液洗三次，每次1

15、 min。 6蒸餾水洗片刻。 7裝片鏡檢。 鏡檢結(jié)果：細(xì)胞中多糖部位呈現(xiàn)紫紅色。（二）細(xì)胞中過(guò)氧化物酶的測(cè)定：聯(lián)苯胺反應(yīng) 1把洋蔥根尖徒手切成2040m厚的薄片或用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊。 2浸在溶有0.1%鉬酸銨的0.85%鹽水溶液中5min（鉬酸銨的作用是催化劑）。 3浸在聯(lián)苯胺溶液內(nèi)2min至切片出現(xiàn)藍(lán)色。結(jié)果：細(xì)胞中有藍(lán)色沉淀出現(xiàn)【作業(yè)】1簡(jiǎn)述PAS反應(yīng)及聯(lián)苯胺反應(yīng)的原理。 2繪圖示細(xì)胞中多糖及過(guò)氧化物酶的分布。實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離【實(shí)驗(yàn)原理與目的】（1）了解細(xì)胞器分級(jí)分離的原理。（2）初步掌握細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離。（3）熟悉離心機(jī)、勻漿器的使用方法。【實(shí)驗(yàn)原理】

16、細(xì)胞組分的分級(jí)分離是研究亞細(xì)胞組分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的基本方法。細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的大小、形狀和密度不同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不同，因此在密度均一的介質(zhì)中，在不同大小的離心力場(chǎng)的作用下，組分先后沉降而初步分離。差速離心只能將那些大小有顯著差異的成分分離開(kāi)，更精細(xì)的分離則要采用密度梯度離心。細(xì)胞組分的分離是通過(guò)組織勻漿、分級(jí)離心等步驟完成的(圖)。圖11. 差速離心技術(shù)各步驟圖解【實(shí)驗(yàn)用品】1玻璃勻漿器、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、普通離心機(jī)、EP管、微量進(jìn)樣器、tip頭、剪刀、鑷子、小燒杯、離心管、載玻片、蓋玻片、滴管、普通光學(xué)顯微鏡、濾紙、8層紗布或尼龍網(wǎng)(200目)、冰塊。2材料：小白

17、鼠肝臟。3試劑：勻漿介質(zhì)(O25molL蔗糖水溶液，含0003molL CaCl2)、甲基綠一派洛寧染液、? 95乙醇、丙酮、生理鹽水、中性紅一詹納斯綠B染液?！驹噭┡渲啤?） 甲基綠-派洛寧染液： 0.2molL醋酸緩沖液(pH48)：冰醋酸12ml，加蒸餾水至100ml；醋酸鈉2.72g溶于100ml蒸餾水中。使用時(shí)兩液按2：3比例混合；A液：5派洛寧水溶液4ml、2甲基綠水溶液14ml、蒸餾水16ml；B液：0.2molI。醋酸緩沖液(pH4.8)16ml。使用時(shí)臨時(shí)將A液與B液混合(52)。2）中性紅-詹納斯綠B染液： 將3滴詹納斯綠B飽和水溶液(溶解度5.18)加到5ml無(wú)水乙醇中，

18、然后再加入1ml 1：15000中性紅溶液(中性紅10mg溶于150ml水中)，瓶子用黑紙包好，4冰箱保存；5ml無(wú)水乙醇中加入2030滴中性紅飽和水溶液(溶解度5.64)；臨用時(shí)將2種溶液等體積混合。3） 0.12 mol/L 草酸銨溶液：? 稱取草酸銨8.527g , 溶解于500ml蒸餾水中3）將燒杯內(nèi)懸浮組織倒入玻璃勻漿器中，使勻漿器的下端浸入盛有冰塊的器皿中，垂直插入勻漿搗桿，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)次使肝組織磨碎。用2層紗布(先用少量勻漿介質(zhì)濕潤(rùn))過(guò)濾勻漿液至離心管中，離心管內(nèi)勻漿液約有78ml。然后制備1張濾液涂A，做好標(biāo)記，自然干燥。4）將裝有勻漿濾液的離心管配平后，在普通離心機(jī)中以25

19、00r分鐘離心15分鐘，緩緩吸取上清液，移入EP管中，蓋緊蓋子放在有冰塊的器皿內(nèi)，待分離線粒體時(shí)用。同時(shí)制備1 張上清液涂片B，做好標(biāo)記，自然干燥。5）用lOml勻漿介質(zhì)懸浮離心后的沉淀物，用吸管混勻，以2500r分鐘離心15分鐘，吸棄上清液，沉降物加入0.30.5ml勻漿介質(zhì)，用吸管吹打成懸液，制備1張涂片C，做好標(biāo)記，自然干燥。2.高速離心分離提取線粒體：1）將放在有冰塊的器皿內(nèi)裝有上清液的EP管取出配平，在臺(tái)式高速離心機(jī)上以13,000r/min離心20分鐘，緩緩吸去上清液，留取沉淀物。如沉淀的表面有一淺色的疏松層時(shí)(主要是一些損傷和腫脹的線粒體)，則應(yīng)連同上清液一起小心吸去。2）沉淀再

20、加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)懸浮，用tip頭吹打后再以13,000r/min離心20分鐘。3）將上清液吸入另一EP管中，留存沉淀物中加入0.1ml的勻漿介質(zhì)混勻成懸液（可用牙簽）。EP管同時(shí)置于冰浴中，待制片鑒定時(shí)用。【內(nèi)容與方法】1.細(xì)胞核。將步驟一中得到的涂片A、B、C浸入95乙醇中5分鐘，晾干，在涂片標(biāo)本上? 滴加甲基綠-派洛寧染液染色2030分鐘，再以純丙酮分色20秒，蒸餾水漂洗，直立于吸水紙上吸干水分，在高倍鏡下比較觀察A、B、C ?3張涂片各含什么成分。細(xì)胞核被染成藍(lán)綠色，核仁和細(xì)胞碎片染成紅色。2.線粒體。取步驟二中得到的沉淀物懸液和上清液分別均勻地涂布在2張干凈載玻片上制備成涂片D和E，

21、各滴1滴0.02中性紅-詹納斯綠B染液，分別蓋上蓋玻片染色520分鐘。在高倍鏡下觀察已染好色的玻片標(biāo)本，其中被染成亮綠色的顆粒是線粒體。比較觀察和描述兩張玻片的結(jié)果?！咀鳂I(yè)與思考題】1.畫出小白鼠肝臟細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離的操作程序圖。 2.觀察、描述、鑒定離心分離物涂片的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)六 線粒體和液泡系的超活染色與觀察一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、 觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布。2、 學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。二、 實(shí)驗(yàn)原理：活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無(wú)毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以

22、致引起細(xì)胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來(lái)研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識(shí)別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部位，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽(yáng)離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽(yáng)離子的，這樣，它們彼此之間就發(fā)

23、生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來(lái)使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因?yàn)樗鼈兙哂腥芙庠陬愔|(zhì)（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B（Janus green B）和中性紅（neutral red）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色各有專一性。三、 實(shí)驗(yàn)用品：1、 器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片、10ml量筒、吸管、牙簽、吸水紙（或衛(wèi)生紙）等。2、 試劑：1） Ringer溶液（裝入滴瓶）氯化鈉 0·85g（變溫動(dòng)物用0·65g）氯化

24、鉀 0·25g氯化鈣 0·03g蒸餾水 100ml2） 1%、1/3000中性紅溶液（裝入棕色滴瓶）稱取0·5g中性紅溶于50mlRinger液，稍加熱（30-40）使之很快溶解，用濾紙過(guò)濾，裝于棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29mlRinger溶液混勻，裝入棕色瓶備用。3） 1%、1/5000詹納斯綠B溶液（裝入棕色滴瓶） 稱取50mg詹納斯綠B溶于5mlRinger溶液中，稍加熱（30-40），使之溶解，用濾紙過(guò)濾后，即為1%原液。取1%原液1ml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液

25、，裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。四、 實(shí)驗(yàn)材料：1、人口腔上皮細(xì)胞2、洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞3、小麥或黃豆幼根根尖五、 方法步驟：（一）、線粒體的超活染色與觀察：線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所，其形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對(duì)線粒體進(jìn)行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)），呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原為無(wú)色的色基（即無(wú)色狀態(tài)）。1、 人口腔黏膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察1）、取清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上，滴兩滴1/5000詹納斯綠B染液。2）、實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰黏膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的黏液狀物放入載玻片的染液滴中，染色1015分鐘（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。3）、在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察。可見(jiàn)扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即是線粒體。2、 洋蔥鱗莖表