番茄轉(zhuǎn)錄因子SlHZ通過(guò)對(duì)D甘露糖L半乳糖通路的正調(diào)節(jié)促進(jìn)抗壞血酸積累

1、金開(kāi)瑞客戶文獻(xiàn)解讀客戶文章分享：番茄轉(zhuǎn)錄因子SlHZ24通過(guò)對(duì)D-甘露糖/L半乳糖通路的正調(diào)節(jié)促進(jìn)抗壞血酸積累基本信息題目：The tomato HD-Zip I transcription fa ctor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway期刊：The Plant Journal影響因子：5.901實(shí)驗(yàn)技術(shù)：酵母單雜交、酵母雙雜交、雙螢光素酶檢測(cè)、EMSA、qPCR合作技術(shù)：EMSA研究背景抗壞血酸（AsA）是一種抗氧化

2、劑，可以清除植物在脅迫條件下產(chǎn)生的活性氧。本文通過(guò)酵母單雜交技術(shù)、瞬時(shí)表達(dá)和EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SlHZ24和SIGMP3啟動(dòng)子結(jié)合，且SlHZ24表達(dá)水平與AsA積累呈正相關(guān)特性。相反，通過(guò)RNAi技術(shù)導(dǎo)致AsA表達(dá)量降低。SlHZ24同時(shí)也影響D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達(dá)，比如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，說(shuō)明抗壞血酸合成為多靶點(diǎn)調(diào)控。SlHZ24過(guò)表達(dá)植株對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性降低，作者推斷SlHZ24促進(jìn)抗壞血酸的合成，提高了植株對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果1. SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白家族本文以維生素C合成主要途徑D-mannose/L-galacto

3、se途徑中關(guān)鍵GMP基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了很重要的角色，據(jù)報(bào)道GMP家族中只有過(guò)表達(dá)SIGMP3提高了抗壞血酸的表達(dá)且改善了氧化應(yīng)激耐受性。因此，本文使用酵母單雜交找尋與SIGMP3啟動(dòng)子作用調(diào)節(jié)抗壞血酸的轉(zhuǎn)錄因子，共找到25個(gè)潛在蛋白，確認(rèn)SlHZ24 為研究對(duì)象。序列分析顯示SlHZ24含有HD和LZ結(jié)構(gòu)域（圖1a），且與其他HD-Zip I蛋白高度同源（圖1b）。進(jìn)化分析的結(jié)果也說(shuō)明SlHZ24與擬南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白。 圖1 SlHZ24序列分析 2. 酵母雙/單雜交驗(yàn)證

4、SlHZ24反式激活作用使用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的實(shí)驗(yàn)組可以在SD/TrpHisAde平板上生長(zhǎng)，而對(duì)照組不能生長(zhǎng)（圖2a）。使用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了不同長(zhǎng)度SlHZ24和SIGMP3啟動(dòng)子的作用，其中SlHZ24全長(zhǎng)、N3、N4、N5、N6、N7包含HD結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為正常生長(zhǎng)，N1不包含HD結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為細(xì)胞不生長(zhǎng)，N2包含不完整的HD結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明HD結(jié)構(gòu)域?yàn)榛プ鼋Y(jié)構(gòu)域（圖2a）。圖2 SlHZ24蛋白在酵母中的活性實(shí)驗(yàn)3. 瞬轉(zhuǎn)及雙螢光素酶檢測(cè)驗(yàn)證SlHZ24與SlGMP3啟動(dòng)子結(jié)合將SlGMP3啟動(dòng)子分成4段進(jìn)行雙螢光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（圖

5、3a、3b），P1和P2啟動(dòng)子區(qū)域檢測(cè)到熒光增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明SlHZ24結(jié)合SlGMP3啟動(dòng)子的第二段序列，即-2411到-2313bp為結(jié)合區(qū)段。圖3 SlGMP3啟動(dòng)子活性檢測(cè)4進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SlHZ24和SlGMP3結(jié)合使用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同的SlGMP3啟動(dòng)子和SlHZ24的結(jié)合情況（圖4a），結(jié)果顯示SlHZ24蛋白與SlGMP3啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)為-2411到-2313bp，突變實(shí)驗(yàn)也證明了這個(gè)結(jié)果（圖4b）。EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了該結(jié)論（圖4c）。這些結(jié)果表明SlHZ24直接與SlGMP3的上游元件結(jié)合來(lái)啟動(dòng)下游表達(dá)。圖4 SlGMP3啟動(dòng)子和SlHZ24結(jié)合實(shí)驗(yàn)5. 不同

6、番茄組織及轉(zhuǎn)基因番茄中SlGMP3和SlHZ24檢測(cè)使用qPCR對(duì)番茄不同組織中的SlGMP3啟動(dòng)子和SlHZ24的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者都在莖和葉總的表達(dá)量較高（圖5a），說(shuō)明SlHZ24正向調(diào)節(jié)SlGMP3表達(dá)。為了驗(yàn)證SlHZ24對(duì)SlGMP3的影響，分別建立的SlHZ24過(guò)表達(dá)和干擾轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)（圖5b）。圖5 SlGMP3和SlHZ24相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)6. SlHZ24通過(guò)調(diào)節(jié)SlGMP3表達(dá)來(lái)改變AsA的合成 對(duì)過(guò)表達(dá)、干擾番茄葉及果實(shí)中AsA的檢測(cè)（圖6a 、6b）實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明SlHZ24在番茄葉和果實(shí)中同時(shí)調(diào)節(jié)抗壞血酸的合成。過(guò)表達(dá)SlHZ24的OX-13植株果實(shí)中

7、SlGMP3基因的表達(dá)量明顯高于野生型，而干擾SlHZ24的KD-9植株果實(shí)中SlGMP3基因的表達(dá)量變化不大（圖6d）。有趣的是在干擾SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達(dá)量顯著減少，而過(guò)表達(dá)SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達(dá)量變化不大（圖6c）。對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄中其他GMP家族基因的檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明SlHZ24可能調(diào)節(jié)多種SIGMP基因（圖6c、圖6d）。圖6 番茄中抗壞血酸濃度及SIGMP表達(dá)水平檢測(cè)7. 番茄中AsA和SlGMP3檢測(cè)為了檢測(cè)番茄果實(shí)成熟過(guò)程中SlHZ24如何影響SlGMP3，對(duì)不同時(shí)期果實(shí)的AsA和SlGMP3表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)（圖7a、7b），結(jié)果表明Sl

8、HZ24在番茄成熟的過(guò)程中可以調(diào)節(jié)SlGMP3的表達(dá)，其中以破色期果實(shí)調(diào)控效應(yīng)最為顯著，除了紅果實(shí)成熟期。圖7 AsA濃度及SlGMP3表達(dá)檢測(cè)8. SlHZ24轉(zhuǎn)基因番茄中D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達(dá)檢測(cè)使用qPCR對(duì)番茄的葉和果實(shí)進(jìn)行了檢測(cè)（圖8a、8b），結(jié)果表明在野生型和轉(zhuǎn)基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表達(dá)量發(fā)生了改變，顯示SlHZ24的多點(diǎn)協(xié)同調(diào)控作用。 圖8 轉(zhuǎn)基因番茄中AsA合成、循環(huán)及氧化相關(guān)基因的檢測(cè)9. SIGME2、SIGGP啟動(dòng)子實(shí)驗(yàn)使用EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子SlHZ24和啟動(dòng)子SIGME2、SIGGP有互做關(guān)系。圖9 EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SlHZ24和

9、啟動(dòng)子SIGME2、SIGGP的結(jié)合作用10. SlHZ24光響應(yīng)及氧化應(yīng)激的作用為了研究光對(duì)AsA的作用，作者對(duì)不同光處理番茄中的AsA和SIHZ24的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)（圖10a、10b），結(jié)果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表達(dá)也隨之提高。使用MV對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行處理，同時(shí)對(duì)葉綠素和MDA濃度進(jìn)行檢測(cè)，說(shuō)明SIHZ24過(guò)表達(dá)可以提高植物對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。圖10 SlHZ24在光響應(yīng)及氧化應(yīng)激的作用文章小結(jié)目前植物合成AsA基礎(chǔ)途徑已經(jīng)明確，但對(duì)AsA合成代謝的調(diào)控機(jī)制知之甚少。本文研究了番茄轉(zhuǎn)錄因子SlHZ24結(jié)合SIGMP3啟動(dòng)子從而增加AsA表達(dá)水平的機(jī)制，進(jìn)而提高植物對(duì)氧化應(yīng)

10、激的耐受性。AsA（又稱維生素C），是生物體一類(lèi)小分子抗氧化劑物質(zhì)，能清除體內(nèi)活性氧，增強(qiáng)有機(jī)體抗氧化能力，保證新陳代謝的正常進(jìn)行。不過(guò)人類(lèi)自身不能合成維生素C，必須從食物中攝取。本研究首次發(fā)現(xiàn)調(diào)控果實(shí)AsA積累的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)揭示AsA調(diào)控機(jī)制和未來(lái)品質(zhì)改良具有重要意義。解析文獻(xiàn)Tixu Hu, Jie Ye, Peiwen Tao, Hanxia Li, Junhong Zhang, Yuyang Zhang* and Zhibiao Ye*.The&#

11、160;tomato HDZip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal (2016) 85, 1629.Tixu Hu, Jie Ye, Peiw

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