番茄轉錄因子SlHZ通過對D甘露糖L半乳糖通路的正調節(jié)促進抗壞血酸積累

1、金開瑞客戶文獻解讀客戶文章分享：番茄轉錄因子SlHZ24通過對D-甘露糖/L半乳糖通路的正調節(jié)促進抗壞血酸積累基本信息題目：The tomato HD-Zip I transcription fa ctor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway期刊：The Plant Journal影響因子：5.901實驗技術：酵母單雜交、酵母雙雜交、雙螢光素酶檢測、EMSA、qPCR合作技術：EMSA研究背景抗壞血酸（AsA）是一種抗氧化

2、劑，可以清除植物在脅迫條件下產生的活性氧。本文通過酵母單雜交技術、瞬時表達和EMSA實驗驗證了SlHZ24和SIGMP3啟動子結合，且SlHZ24表達水平與AsA積累呈正相關特性。相反，通過RNAi技術導致AsA表達量降低。SlHZ24同時也影響D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達，比如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，說明抗壞血酸合成為多靶點調控。SlHZ24過表達植株對氧化應激的敏感性降低，作者推斷SlHZ24促進抗壞血酸的合成，提高了植株對氧化應激的耐受性。研究內容及結果1. SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白家族本文以維生素C合成主要途徑D-mannose/L-galacto

3、se途徑中關鍵GMP基因為切入點。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了很重要的角色，據(jù)報道GMP家族中只有過表達SIGMP3提高了抗壞血酸的表達且改善了氧化應激耐受性。因此，本文使用酵母單雜交找尋與SIGMP3啟動子作用調節(jié)抗壞血酸的轉錄因子，共找到25個潛在蛋白，確認SlHZ24 為研究對象。序列分析顯示SlHZ24含有HD和LZ結構域（圖1a），且與其他HD-Zip I蛋白高度同源（圖1b）。進化分析的結果也說明SlHZ24與擬南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白。 圖1 SlHZ24序列分析 2. 酵母雙/單雜交驗證

4、SlHZ24反式激活作用使用酵母雙雜交實驗驗證了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的實驗組可以在SD/TrpHisAde平板上生長，而對照組不能生長（圖2a）。使用酵母單雜交實驗驗證了不同長度SlHZ24和SIGMP3啟動子的作用，其中SlHZ24全長、N3、N4、N5、N6、N7包含HD結構域表現(xiàn)為正常生長，N1不包含HD結構域表現(xiàn)為細胞不生長，N2包含不完整的HD結構域表現(xiàn)為生長緩慢，說明HD結構域為互做結構域（圖2a）。圖2 SlHZ24蛋白在酵母中的活性實驗3. 瞬轉及雙螢光素酶檢測驗證SlHZ24與SlGMP3啟動子結合將SlGMP3啟動子分成4段進行雙螢光素酶檢測實驗（圖

5、3a、3b），P1和P2啟動子區(qū)域檢測到熒光增強，實驗結果說明SlHZ24結合SlGMP3啟動子的第二段序列，即-2411到-2313bp為結合區(qū)段。圖3 SlGMP3啟動子活性檢測4進一步實驗驗證SlHZ24和SlGMP3結合使用酵母單雜交實驗驗證不同的SlGMP3啟動子和SlHZ24的結合情況（圖4a），結果顯示SlHZ24蛋白與SlGMP3啟動子的結合位點為-2411到-2313bp，突變實驗也證明了這個結果（圖4b）。EMSA實驗進一步證明了該結論（圖4c）。這些結果表明SlHZ24直接與SlGMP3的上游元件結合來啟動下游表達。圖4 SlGMP3啟動子和SlHZ24結合實驗5. 不同

6、番茄組織及轉基因番茄中SlGMP3和SlHZ24檢測使用qPCR對番茄不同組織中的SlGMP3啟動子和SlHZ24的表達量進行了檢測，發(fā)現(xiàn)兩者都在莖和葉總的表達量較高（圖5a），說明SlHZ24正向調節(jié)SlGMP3表達。為了驗證SlHZ24對SlGMP3的影響，分別建立的SlHZ24過表達和干擾轉基因番茄進行下一步實驗（圖5b）。圖5 SlGMP3和SlHZ24相對表達量檢測6. SlHZ24通過調節(jié)SlGMP3表達來改變AsA的合成 對過表達、干擾番茄葉及果實中AsA的檢測（圖6a 、6b）實驗，說明SlHZ24在番茄葉和果實中同時調節(jié)抗壞血酸的合成。過表達SlHZ24的OX-13植株果實中

7、SlGMP3基因的表達量明顯高于野生型，而干擾SlHZ24的KD-9植株果實中SlGMP3基因的表達量變化不大（圖6d）。有趣的是在干擾SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達量顯著減少，而過表達SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達量變化不大（圖6c）。對轉基因番茄中其他GMP家族基因的檢測結果說明SlHZ24可能調節(jié)多種SIGMP基因（圖6c、圖6d）。圖6 番茄中抗壞血酸濃度及SIGMP表達水平檢測7. 番茄中AsA和SlGMP3檢測為了檢測番茄果實成熟過程中SlHZ24如何影響SlGMP3，對不同時期果實的AsA和SlGMP3表達量進行了檢測（圖7a、7b），結果表明Sl

8、HZ24在番茄成熟的過程中可以調節(jié)SlGMP3的表達，其中以破色期果實調控效應最為顯著，除了紅果實成熟期。圖7 AsA濃度及SlGMP3表達檢測8. SlHZ24轉基因番茄中D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達檢測使用qPCR對番茄的葉和果實進行了檢測（圖8a、8b），結果表明在野生型和轉基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表達量發(fā)生了改變，顯示SlHZ24的多點協(xié)同調控作用。 圖8 轉基因番茄中AsA合成、循環(huán)及氧化相關基因的檢測9. SIGME2、SIGGP啟動子實驗使用EMSA實驗驗證轉錄因子SlHZ24和啟動子SIGME2、SIGGP有互做關系。圖9 EMSA實驗驗證SlHZ24和

9、啟動子SIGME2、SIGGP的結合作用10. SlHZ24光響應及氧化應激的作用為了研究光對AsA的作用，作者對不同光處理番茄中的AsA和SIHZ24的表達量進行了檢測（圖10a、10b），結果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表達也隨之提高。使用MV對轉基因番茄進行處理，同時對葉綠素和MDA濃度進行檢測，說明SIHZ24過表達可以提高植物對氧化應激的耐受性。圖10 SlHZ24在光響應及氧化應激的作用文章小結目前植物合成AsA基礎途徑已經(jīng)明確，但對AsA合成代謝的調控機制知之甚少。本文研究了番茄轉錄因子SlHZ24結合SIGMP3啟動子從而增加AsA表達水平的機制，進而提高植物對氧化應

10、激的耐受性。AsA（又稱維生素C），是生物體一類小分子抗氧化劑物質，能清除體內活性氧，增強有機體抗氧化能力，保證新陳代謝的正常進行。不過人類自身不能合成維生素C，必須從食物中攝取。本研究首次發(fā)現(xiàn)調控果實AsA積累的轉錄因子，對揭示AsA調控機制和未來品質改良具有重要意義。解析文獻Tixu Hu, Jie Ye, Peiwen Tao, Hanxia Li, Junhong Zhang, Yuyang Zhang* and Zhibiao Ye*.The&#

11、160;tomato HDZip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal (2016) 85, 1629.Tixu Hu, Jie Ye, Peiw

12、en Tao, et al.The tomato HDZip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal (2016) 85, 1629.參考文獻1. Ariel, F.D., Manavella, P.A., Dezar, C.A. and Chan, R.L. (2007) The true story of the HD-Zip family.

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