真核細胞基因表達的調控

1、MCB課程 真核細胞的基因表達和調控一，生物體內遺傳物質的基本結構和功能單位是基因 上個世紀70年代在細胞生物學，細胞遺傳學和生物化學的基礎上，經過一系列重大發(fā)現而奠定基礎，逐步發(fā)展形成了分子生物學(molecular biology)這一現代生命學科。分子生物學認為生物體內存在著決定生物體性狀的遺傳物質，其基本的結構和功能單位是基因(gene)。基因的本質是一段攜帶著能合成功能蛋白質所需的全部信息的DNA，其中包括著蛋白質的編碼序列，也包括非編碼的調控序列。基因主要具有兩大功能。一是指導合成蛋白質，通過蛋白質發(fā)揮的功能將遺傳信息轉換成具體的細胞性狀和功能；二是通過細胞有絲分裂過程中的DNA復

2、制(replication)，將遺傳信息傳遞給子代細胞，從而保持子代細胞與母代細胞性狀的一致性?；蛟陔p螺旋結構的DNA長鏈組成的染色體上呈線性排列。在哺乳動物的真核細胞中線性排列的基因以核小體 (nucleosome) 的形式被緊密包繞存在于細胞核中，組成核染質(chromatin)。核小體的核心是由H2a,H2b,H3和H4四組組蛋白形成的八聚體，核心外包繞著1又3/4圈的DNA長鏈。因此在電鏡下核染質呈“串珠樣“結構。由于基因的本質是呈雙螺旋結構的方向相反的兩條脫氧核糖核酸（DNA）分子，因此基因的排列具有方向性，其DNA分子的5端為基因的上游，3端為基因的下游。構成基因DNA分子序列的

3、有腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G）4種堿基。在雙鏈DNA分子中一條DNA分子上的A總是以兩條氫鍵與 另一條DNA分子上的T相結合，而C總是以三條氫鍵與G相結合。A與T，C與G之間稱為互補關系(complementary)。雙鏈DNA分子中A,T,C,G的不同組合排列形成了三聯密碼，每一個三聯密碼都代表著一種相應的氨基酸。然而，基因中的編碼序列往往并不連續(xù)，其中間隔著非編碼的序列。這些編碼的序列稱為基因結構中的外顯子，而非編碼序列稱為內含子。在基因的上游端具有啟動基因表達作用的特殊序列稱為啟動子，它們的序列中富含A,T,C, 在基因的上游，下游較遠處，乃至基因內部還有某些序列

4、對基因的表達有明顯的促進作用，稱為增強子?；虻南掠味送€有基因表達的終止信號。上述基因本身的主要結構統稱為基因的順式元件，而參與基因表達過程的基因外的蛋白質因子稱為基因的反式元件（見下節(jié)）。上述排列著基因的DNA成為基因組DNA，真核細胞中除了基因組DNA攜帶遺傳信息外，線粒體中能獨立復制的DNA也攜帶著遺傳信息。( 圖1: 分子生物學的中心法則-基因的表達 )二，生物個體的基因型決定了表現型分子生物學的中心法則 生物體內基因所攜帶的遺傳信息是通過分子生物學中心法則(central dogma)所表述的過程轉變成生物體的性狀的。中心法則表明，一方面基因作為DNA可以通過復制使遺傳信息傳遞給

5、新生的DNA分子，從而傳給子代細胞。另一方面，攜帶遺傳信息的DNA分子可以作為模版，通過轉錄(transcription)而傳遞給轉錄產物RNA（核糖核酸）分子, RNA又能通過翻譯(translation)將其攜帶的遺傳信息再轉換成多肽/蛋白質，從而使基因所攜帶的遺傳信息最終轉換成功能蛋白質而賦予生物體細胞特定的性狀?；虻倪z傳信息從DNA的形式最終轉換成功能蛋白質的整個過程稱為基因的表達。生物體內基因的結構和功能形式稱為基因型(genotype)，而生物體表現的外部形狀稱為表現型(phenotype)。所以，理論上生物體有怎樣的基因就會產生怎樣的性狀。生物體的基因型決定了表現型。但在實際的

6、具體生物個體上，基因型與表現型的關系不一定很明確。特別是在真核細胞生物中，一方面其細胞中含有比原核細胞復雜得多的遺傳物質，其基因的數目成千上萬，基因結構更精細更復雜。而這些遺傳物質以一定的方式被緊緊包裹壓縮在細胞核內的極小的空間里。另一方面，真核細胞生物大多數為多細胞生物，生物體內往往已進化出多種組織細胞，它們具有完全相同的基因型，卻在生物體生長發(fā)育的不同階段表現出不同的表型和功能。 所以，作為多細胞組成總體的真核細胞生物來說，許多基因的功能不一定能在外部明確表現出來，許多基因的功能之間可以重疊和互補，因而掩蓋了某一單個基因的功能。同時，具有某一種功能的基因都是以等位基因的形式成對地分別排列在

7、一對染色體的相應位點上的。如果等位基因中的一個基因發(fā)生缺損，另一基因仍正常發(fā)揮功能，生物體的性狀并不發(fā)生改變，必須兩個基因都失去功能，生物體的性狀才會發(fā)生改變。這樣的基因稱為隱性基因。如果等位基因中的一個基因發(fā)生缺損生物體的性狀即發(fā)生改變。這樣的基因稱為顯性基因。此外在形成生殖細胞的減數分裂過程中，線性排列在一對染色體上的幾個基因有可能由于一段染色體的同源交叉(crossover)而變換位置，發(fā)生重組。如果不同基因之間距離很近，往往同時變換位置，因而重組體的子代細胞中，它們決定的幾種性狀也往往同時出現或改變。這些基因之間稱為具有連鎖關系(linkage). 位于性染色體X上的基因為性連鎖基因，

8、它們所決定的性狀與一定的性別同時出現，稱為伴性遺傳。 總之，真核細胞生物的基因型和表現型之間的相互關系日趨復雜和精細，而兩者之間的關系，即細胞的基因型如何轉換成表現型，就取決于基因如何表達的過程和被調控的機理。Staudt LM. N Engl J Med. 2003;348:1777-1785三，真核細胞內基因的表達過程和調控機理 真核細胞內的基因表達是一個多步驟的，連續(xù)的，精細復雜的過程。主要可分為轉錄，轉錄后加工，翻譯和翻譯后修飾三個大階段。轉錄是基因表達的第一步，是在細胞核內由單鏈的基因組DNA為模版，以RNA聚合酶和一系列酶為工具進行的合成反應，其產物是單鏈的RNA分子。轉錄從基因上

9、游5端的啟動子開始，RNA聚合酶II為主的轉錄復合物（主要是通用轉錄因子GTFs與其他因子構成的全酶 holoenzyme）.結合到啟動子上后不斷沿著DNA模版向基因的3端移動，轉錄也即開始從基因的5端向3端進行。直到RNA聚合酶II為主的轉錄復合物達到模版上基因的終止信號后，轉錄復合物即與模版分離，使轉錄停止。轉錄過程中RNA聚合酶II根據與DNA模版序列的互補原則，將帶有四種堿基的核苷酸聚合成RNA分子，不過RNA中不存在T，由與A互補的U代替。為了使RNA聚合酶和其他蛋白質因子易于結合到基因的啟動子上，首先必須使基因所在的核染質的空間構型松解開放，雙鏈DNA必須解聚為單鏈，這些都需要一系

10、列酶的參與，如拓撲酶，解旋酶等，也涉及核染質構型的重塑機制 (chromatin remodeling). 這一過程主要是由構成核小體中的組蛋白在核內酶的作用下發(fā)生周期性的乙?；腿ヒ阴；瑥亩购巳举|的構型不斷發(fā)生緊縮閉合和松解開放的交替變化。當核染質松解開放時，外來的轉錄因子等蛋白質容易接近而與DNA上基因的轉錄啟始點結合而啟動基因的轉錄；反之，當核染質變得緊縮閉合時，外來的轉錄因子等蛋白質難以接近DNA上基因的轉錄啟始點，因而抑制基因的轉錄。AcetylationDeacetylation （圖2: 核小體組成的核染質的重塑）新生的轉錄產物RNA稱為核內不均一RNA，很不穩(wěn)定，容易降解。

11、必須經過RNA的轉錄后加工(post-transcriptional processing)才能成為穩(wěn)定的mRNA. 大約只有15-20%的核內不均一RNA被加工成mRNA.，通過細胞核核膜上的核孔輸出到細胞質中，到核糖體上進一步翻譯。RNA的轉錄后加工主要包括在5端加上 M-7Gppp 帽，在3端加上約20個多聚腺苷酸 (poly A)的尾,以及RNA分子的剪切(splicing). 剪切是復雜精細的過程，由核內剪切子(spliceosome)或稱snRNPs介導進行，它可識別RNA中內含子5端和3端的GU和AG，將前后兩個外顯子的兩端拉近，中間內含子部分形成的攀被RNA酶切除后，各外顯子就

12、連接成完整的mRNA.。由于剪切過程中可以發(fā)生不同的剪切方式，即選擇性剪切 (alternative splicing), 形成的mRNA.中可能含有同一基因的多段不同的外顯子成分，因而可翻譯成幾種結構和功能不完全相同的蛋白質異構體。使單一的基因可以編碼幾種蛋白質。mRNA在細胞質內翻譯的場所是核糖體(ribosome),它由60S 和40S的兩個亞單位組成，其中分別含有28S 和18S兩種核糖體RNA（rRNA）。mRNA分子遭遇附著核糖體后，其戴帽的5端就從兩個亞單位之間穿過并前行。也即核糖體沿著作為模版的mRNA從5端向3端移動。隨著移動核糖體就能讀出mRNA分子序列中的三聯密碼，每種三

13、聯密碼都編碼一種氨基酸，但每種氨基酸可以有幾種相應的三聯密碼，其中AUG不編碼氨基酸，而代表翻譯的起始密碼，UAA，UGA和 UAG代表翻譯終止的密碼?；虻姆g還需要轉運RNA（tRNA）的參加。tRNA分子呈三葉草狀，一條臂可與rRNA相連合，一條臂攜帶一個氨基酸，另一條臂為反密碼臂。當核糖體讀到某三聯密碼時，具有與此密碼互補的反密碼臂的tRNA就會結合到核糖體上，從而將相應的氨基酸帶來并整合到氨基酸鏈上。隨著氨基酸的增加，合成的肽鏈不斷延長。直到核糖體讀到終止密碼，mRNA分子與核糖體分離，翻譯即告終止。從AUG開始，三聯密碼必須遵循一定的開放閱讀框架 (open reading fra

14、me ORF) 閱讀，直到終止密碼，才能合成正確的氨基酸肽鏈，如果ORF改變，合成的氨基酸肽鏈也就變了。例如當mRNA模版發(fā)生突變或缺失時ORF發(fā)生改變。此時，合成的肽鏈中某些氨基酸可能發(fā)生改變，使其功能受到一定影響，這種突變成為誤義突變。也可能所發(fā)生突變或缺失使終止密碼提早出現，從而使肽鏈不能合成或僅僅能合成很短，并導致喪失功能，這種突變成為無義突變。一條mRNA模版可以同時穿過多個核糖體，也即多個核糖體可同時按序從mRNA分子的5端向3端移動，所以一條mRNA模版可以同時翻譯合成多條肽鏈。翻譯合成的肽鏈尚不是最終產物功能蛋白質，還必須經過翻譯后加工，包括肽鏈間的連接裁剪，形成蛋白質后分子的

15、折疊，以及糖基化，磷酸化，乙?；刃揎?，才能最后成為具有功能的蛋白質。（圖3: 真核細胞基因轉錄調控的模式圖）處于某一時刻的真核細胞內并非所有的基因都在同時有同樣水平的表達。對于一個細胞體內每時每刻都在進行的如此精細復雜的多步驟的連續(xù)過程，顯然需要有一套精密靈敏的調控機制加以掌握，才能保證所有基因在質，量和時空各方面的準確高效表達，以敷細胞各種生理功能行為之需。如果表達調控機制出了差錯，必然使細胞遭受危害，甚至是致命的打擊。所以基因表達的調控機理是分子生物學理論研究的核心問題。目前可將基因表達調控的機理簡單歸納如下：在轉錄前，主要是確定將啟動表達的有哪些基因，此基因所在的核染質構型是否松解開放

16、，該基因是否具備完備有效的啟動子等順式元件和其他轉錄條件。而被啟動表達的基因往往必須首先感知到編程的信號或來自細胞外部而傳入的信號，所以這些信號和指令是基因表達的先決條件。在轉錄過程中，影響轉錄效率的主要是結合到DNA模版上的各種轉錄因子(transcription factor)。轉錄因子的發(fā)現至今已逾20年，做為基因轉錄的反式元件，早先對轉錄因子的一般概念是它含有兩種結構域: DNA結合結構域使之與DNA相連，激活或抑制結構域使之能調控轉錄。近年的研究對轉錄因子的認識又有顯著的深化和發(fā)展。例如，轉錄因子在缺乏DNA結合結構域時也可通過蛋白質之間的相互作用而與基因DNA上的啟動子結合。又如轉

17、錄因子可同時含有激活和抑制結構域，而DNA結合結構域本身就可起轉錄調控結構域的作用。另一個重要概念是轉錄因子一般并非單獨起作用，而是多個轉錄因子通過相互作用，協同或組成復合物形式來調控轉錄。轉錄因子的作用需要其他蛋白質作為共活化或共抑制因子參與，而轉錄因子的功能本身也受一些小分子或其本身翻譯后的修飾所調控，這種調控可通過多渠道，并發(fā)生在多層面上。影響轉錄水平的另一重要機理是基因啟動子序列內CpG的甲基化，高甲基化會導致基因的低轉錄表達，甚至使基因沉默(gene silencing). 這些機理都是當前研究的熱點。轉錄后的調控主要作用于RNA的加工環(huán)節(jié)。新生的RNA分子能否正確地“戴帽”“加尾”

18、關系到形成的mRNA的穩(wěn)定性，能否穩(wěn)定地被運輸到細胞質中，并順利附著到核糖體上進行下一步的翻譯。不能“戴帽”“加尾”的RNA將很快降解。另一個轉錄后加工的重要環(huán)節(jié)就是剪切。它關系到轉錄產物是否正確以及最終是否能獲得功能蛋白質產物。這一步驟精細復雜，往往易出差錯而影響下一步的翻譯，是進行調控的重要環(huán)節(jié)。翻譯過程中主要影響因素是mRNA分子5端帽結構和3端的非翻譯區(qū)5-UTR和 3-UTR，其中前者的影響更大。5-UTR的突變或缺失會使翻譯效率大受影響。mRNA的穩(wěn)定性也是影響翻譯效率的重要因素。穩(wěn)定的mRNA分子可在較長時間內作為模版而翻譯出較多的肽鏈，而不穩(wěn)定的mRNA分子僅能充當幾次模版就降

19、解了。綜上所述，基因的表達處在非常復雜的調控機理控制下，任何環(huán)節(jié)發(fā)生問題和差錯，都會導致基因表達在質，量和時空方面的異常，從而導致細胞表型的紊亂，影響細胞的正常生理功能和行為。四，真核細胞基因轉錄的表觀遺傳學調控：近年來提出了表觀遺傳學調控的概念。這一概念主要來自對真核細胞發(fā)育進化過程的考察發(fā)現真核細胞內的基因的數量增加與其功能的多樣化完全不相稱。最明顯的現象是人類基因組的研究結果表明人類的基因組中只含有大約28000 - 30000個基因，而這比人們根據人類所具有的復雜功能所想象的基因數目要少得多，與簡單的低等動物的基因組中的基因數相比并沒有多少增加。在類似的環(huán)境下的遺傳背景相似的真核細胞生

20、物，其表現出來的功能表型可以有很大的差異。這些現象提示真核細胞生物進化過程中獲得的復雜多樣的表型并非僅靠基因數目的增加，而更重要是靠每一個基因表達方式的增加，即單個基因表達能被編程和調控的方式變得越來越復雜多樣。這些無形的基因表達和調控的方式并不因為母代細胞分裂為子代細胞而消失，相反它可以在基因數目本身和DNA序列并無改變的情況下通過減數分裂或有絲分裂而遺傳給子代。所以我們現在可以將真核細胞內包含的信息分為兩種：有形的遺傳信息和無形的表觀遺傳信息。遺傳信息為真核細胞制造所有必須的蛋白質提供了藍圖，而表觀遺傳學信息則為細胞何時何地如何使用這些藍圖提供了指令。在結構基因組學進入功能基因組學的時代，

21、很顯然，研究無形的表觀遺傳學的調控機理比有形的基因結構的遺傳學對闡明真核細胞生物的功能具有更重大深遠的意義。 目前認為表觀遺傳學機理是細胞genotype和phenotype之間的橋梁。在細胞genotype不變的情況下，環(huán)境的作用也會通過影響表觀遺傳學的調控機理，從而改變細胞的phenotype。不過環(huán)境影響所致的表觀遺傳學的改變往往非常微細和緩慢，不易覺察，且這種改變在特定時間段內是可逆的，因此，細胞的Phenotype 的改變不一定顯現出來。各組織體細胞隨著正常的發(fā)育分化過程根據其內在的表觀遺傳學機理對基因的總體轉錄實行編程(program), 決定基因轉錄的態(tài)勢，從而賦予分化成熟的各組

22、織細胞特定的表型。如果人為地改變環(huán)境而改變一系列表觀遺傳學作用機制，可以使體細胞內基因轉錄的總態(tài)勢被“重編程”(reprogramming)，從而改變體細胞的Phenotype,甚至賦予成熟的體細胞新的“多能性”(pluripotency)。多細胞的真核細胞內基因表達激活的核心問題是基因所處的染色質的修飾，即一方面包裹在致密的染色質中的某個靶基因如何通過染色質組蛋白的修飾和重塑而被識別并激活，另一方面又需防止這些修飾重塑的染色質的范圍蔓延擴散而使不應表達的基因被激活。典型的染色質修飾起源于基因組的某一點（一般相當于某基因的增強子），再向周圍擴散，一般是單方向的。這種染色質的修飾會受到某些基因邊

23、緣的DNA序列的限制，這些序列稱為邊界元素(boundary element)或絕緣子(insulator)，對它們的作用和機理目前所知甚少。這些序列可能與特定的蛋白質結合，也可能在復合位點中將不同組織特異性增強子分隔開，使某一時間只有一種增強子發(fā)揮功能。邊界元素防止中心粒或端粒處的異染色質擴散到常染色質區(qū)域。4.1，染色質結構的重塑機理及基因轉錄調控 染色質結構的重塑調控基因的轉錄主要通過兩種復合物來進行。一是ATP依賴的酶復合 物，應用ATP作為能量水解破壞和改變局部組蛋白與DNA鏈之間結合；二是組蛋白的乙 酰化和去乙?；笍秃衔锔淖兘M蛋白氨基端的乙?；潭?。 , 組蛋白的乙?；腿ヒ阴；?/p>

24、與基因轉錄活化和抑制 組蛋白的翻譯后乙?；腿ヒ阴；饕山M蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase, HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase, HDAC）復合物分別執(zhí)行。組蛋白的乙?；欣诨蜣D錄的活化。近年來發(fā)現的組蛋白乙?；福╤istone acetylase）有p300/CBP(CREB-binding protein)。它是CREB(cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein) 轉錄因子的共刺激因子。許多轉錄因子都需與p300/CBP結合成復合

25、物來激活轉錄。p300/CBP本身具有乙?；富钚?，與其結合的p/CAF和 hGCN5以及TAF250也可能有組蛋白乙?；富钚?。這幾種乙?；附M成的復合物被轉錄因子帶到特異性基因啟動子激活轉錄。此外ACTR (activator of the thyroid and retinoic acid receptor) 和 SRC-1(steroid receptor coactivator)也具有乙?；富钚?，在某些基因轉錄活化中起作用。多種組蛋白乙?；竿M成不同的復合物共同激活一個基因的轉錄，提示不同的乙?；缚赡茏饔糜诓煌暮藘冉M蛋白底物，表明了問題的復雜性。 另一方面，組蛋白的去乙?；?/p>

26、抑制基因的轉錄。長期以來就知道某些物質，如丁酸鈉，trichostatin A和 trapoxin 會造成組蛋白高乙?；?。它們都是組蛋白去乙?；福℉DAC）的抑制劑，丁酸鈉的作用較為非特異，而trichostatin A和 trapoxin分別可逆和不可逆地特異性抑制組蛋白去乙酰化酶。HDAC是進化中高度保守的，它一般都以與Sin3 和Rb等共抑制因子組成的復合物形式存在，并被某些特異的DNA結合性轉錄因子，如Mad, E2F和未結合配體的核激素受體，帶到DNA特定序列附近。近來研究發(fā)現HDAC涉及基因前CpG的甲基化過程而抑制基因的轉錄，甲基化的CpG及與之特異性結合的Mecp2蛋白已知能

27、使基因沉默。目前認為是Mecp2能將Sin3和HDAC拉近DNA上的啟動子序列從而抑制轉錄。有趣的是，大多數組裝著HDAC復合物的DNA序列都可對其下游基因轉錄有著兩種相反的調控功能，是使轉錄增強還是沉默取決于組裝其上的是組蛋白乙?；笍秃衔?，還是HDAC復合物。不同真核細胞內有多種HDAC/Rpd3蛋白質。人類的3種HDAC/Rpd3蛋白質在各種組織細胞中都表達，似乎沒有組織特異性的表達譜，對 4種組蛋白底物也未報導有作用特異性。其轉錄抑制功能來自去乙?；拿笇W活性，如果HDAC/Rpd3突變使去乙?；钚匀毕?，則以顯性負作用方式使轉錄抑制功能喪失。 , ATP依賴性染色質結構重塑復合物與基

28、因轉錄調控 除了對組蛋白的乙?；揎椡?，另一類參與染色質結構重塑的酶復合物也調控基因的轉錄，它們含有腺嘌呤三磷酸腺苷酶(ATPase) 活性，能利用ATP提供能量水解而破壞或改變局部DNA與組蛋白間的相互作用。這類復合物包括酵母中的SWI/SNF 和高等真核細胞中的 BRG1和BRM. 它們都能改變核小體的結構而使轉錄因子易與之結合。酵母中的RSC (remodeling the structure of chromatin)和果蠅中的NURF (nucleosome-remodeling factor)都含這類復合物。這些不同物種的復合物中雖然包括不同的組分并具有各異的性質，但他們都含有SW

29、I/SNF相關的亞單位，因而具有ATPase 和螺旋酶(Helicase)活性。實驗表明人類hSWI/SNF的作用是使核小體在正常構型和較開放的構型之間可逆地交互變換。這一變換之際為轉錄因子接近并與DNA結合提供了機會。雖然一般認為ATP驅動的染色質重塑活性與組蛋白乙?；煌?，但近來的研究表明兩種活性可能密切相連。例如應用HDAC1和HDAC2單抗提純細胞內組蛋白去乙酰化酶相關蛋白時，發(fā)現多個含有HDAC1/2的蛋白復合物，而在這樣的復合物中就有兩種蛋白質(CHD-3,CHD-4)是SWI/SNF樣蛋白質，具有ATP依賴性染色質結構重塑活性。這種活性雖非為使組蛋白去乙酰所必需，但能促進其組蛋白

30、去乙?；傅幕钚?。此復合物稱為NRD (nucleosome remodeling and histone deacetylases), 其兩種活性相輔相成，能充分地調控基因的轉錄。哺乳動物細胞中BRG1和BRM.具有ATPase酶活性，是SWI/SNF復合物中的主要成分，有利于促進轉錄。它們常與Rb蛋白相互作用，而Rb常會拉近組蛋白去乙?；竵硪种妻D錄。這提示兩種相反的染色質重塑活性結成對子，可能是調控轉錄的一種常見形式。長期以來，人們較多關注轉錄因子對真核細胞基因轉錄的作用，近兩年的發(fā)現表明轉錄因子激活轉錄還必須通過與某些基本的轉錄復合物中的成分相互作用來實現。轉錄需要分幾步進行。第一步由

31、上述兩種不同的染色質重塑機制（組蛋白乙?；虯TP依賴性染色質重塑活性）協同重塑細胞染色質，然后由轉錄因子和基本的轉錄復合物中的成分相互作用，并與基因啟動子DNA上轉錄活化基序結合，從而使轉錄復合物參與激活轉錄。在這過程的開始，一類轉錄因子可能首先與處于核小體之間的DNA上轉錄因子結合位點結合，并將組蛋白乙酰化酶復合物拉近DNA而乙?；诵◇w中的組蛋白，開放核小體結構，使之易于接受其他轉錄因子或基本轉錄復合物。然后第二類轉錄因子再引入其他基本轉錄復合物而激活轉錄。同樣，轉錄抑制可能也是這樣兩步的過程。 , DNA甲基化和染色質蛋白甲基化對基因轉錄的影響 基因組含有遺傳(genetic)和表觀遺

32、傳(epigenetic)兩類信息。遺傳信息為合成生命所需的全部蛋白質提供藍本，而遺傳外信息為遺傳信息在何時何地如何發(fā)揮作用提供指令。最重要的遺傳外信息是DNA的甲基化，也即在CpG中的胞嘧啶的5位上以共價鍵加上甲基基團的態(tài)勢。DNA的甲基化對哺乳動物的基因組有重大的影響，包括對基因轉錄的抑制，染色質結構修飾，X染色體失活和基因組的完整性和穩(wěn)定性等。CpG的甲基化由三種獨立的甲基轉移酶DNMT1, DNMT3A 和DNMT3B催化。最近還克隆了第四種甲基轉移酶DNMT2。利用果蠅基因敲除實驗表明DNMT3屬于“初始類”（de.novo）,而DNMT1屬于“維持類”（maintenance）。因

33、為DNMT1敲除的ES細胞仍能保持初始的甲基化活性，而DNMT3A 和DNMT3B的純合缺失并不能改變ES細胞中已存在的DNA甲基化態(tài)勢。但DNMT1基因的雜合性缺失卻造成甲基化胞嘧啶的含量減少70%。不過某些轉基因實驗的結果也提出了爭議。有可能此3種DNMT酶在體內都具有起始和維持甲基化的功能，它們對特定的基因組DNA的轉甲基功能必須視與其他核蛋白或DNA結合因子的相互作用而定。ICF是一種極為罕見的常染色體隱性遺傳病，具有嚴重的免疫缺陷（至少2種免疫球蛋白嚴重減低），伴有呼吸道感染，不同程度智力低下，發(fā)育遲緩和奇特面容。目前研究表明，ICF可能由DNMT3B基因在不同區(qū)段的突變而使甲基化功

34、能減低或影響其與其他DNA結合蛋白的相互作用所致。多種智力低下的遺傳病均有細胞內甲基化的缺陷，提示甲基化介導的染色質修飾可能對腦的發(fā)育具有特殊的重要意義。在腫瘤細胞中，基因組的甲基化態(tài)勢經常有很大改變。在基因組整體低甲基化的大環(huán)境中特定區(qū)域出現高甲基化。大多數低甲基化發(fā)生在正常時原本高甲基化的重復或“寄生”的元件區(qū)域，使這些轉座元件的轉錄增加而增加了基因組的不穩(wěn)定性。許多實驗證據表明DNA甲基化對腫瘤發(fā)生具有早期直接的作用。例如在某些抑癌基因（如Rb）的啟動子處發(fā)生高甲基化，就可使抑癌基因的表達沉默而使細胞獲得增殖的優(yōu)勢。又如具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的大腸癌細胞中錯配基因hMLH1的啟動子也發(fā)生高甲

35、基化而導致轉錄沉默。此外，在實驗性腫瘤模型和自然發(fā)生的肺癌上皮細胞中也可測知P16INK4a的啟動子高甲基化。在腫瘤細胞DNA中約45000個CpG中，有人分析了98種腫瘤標本中的1184個CpG的甲基化狀態(tài)，發(fā)現平均608個CpG有異常甲基化（最高可達4500個CpG）。但甲基化程度在不同個體和不同腫瘤類型之間有差別。乳腺，頭頸部和睪丸瘤的CpG異常甲基化率較低而大腸癌，腦膠質瘤和白血病細胞的異常甲基化率顯著增高。此外，CpG的異常甲基化并非隨機分布，提示某些基因CpG比其他處更易甲基化或某些基因CpG丟失甲基化能使細胞獲得生長優(yōu)勢。甲基化的DNA可能通過與之結合的MeCP2蛋白拉近HDAC

36、，而使局部染色質核組蛋白去乙酰化，從而抑制轉錄。除了MeCP2以外，近來還發(fā)現MBD1,2,3 , RbAp46/48等蛋白質也與甲基化的DNA相連，并與染色質重塑機理相關。除了DNA甲基化外，近來發(fā)現核內組蛋白在賴氨酸和精氨酸位上的甲基化也能與組蛋白的其他翻譯后修飾共同調控染色質構型和基因的轉錄。在H3分子的核心及尾部的多處賴氨酸位點，以及H4尾部單個賴氨酸位點可發(fā)生甲基化，此外，還有H3的三處精氨酸位點和H4上一處精氨酸位點也發(fā)生甲基化。許多轉錄因子和與RNA加工過程相關的蛋白質也都會甲基化，提示核內許多蛋白質的甲基化也可通過其他途徑調控轉錄或轉錄后步驟。在表觀基因組(Epigenome)

37、中（見下圖），H3K4me1, H3K36me3和H3K4ace是染色質開放（呈常染色質），基因轉錄活化的標志；相反，H3K9me2,3和H3K27me3是染色質閉鎖（異染色質），基因轉錄受抑而靜息的標志。組蛋白賴氨酸的甲基化由賴氨酸甲基轉移酶(KMTs或 HMTs)催化。這些酶大多數含有保守區(qū)SET結構域。與組蛋白乙?；嗤?，組蛋白甲基化也是可逆的。兩族賴氨酸去甲基化酶(KDMs), 包括LSD1和Jumonji酶可使H3或H4的賴氨酸去甲基化。同樣，不同的酶也可使精氨酸去甲基化。這些組蛋白甲基化和乙?；揎椣嗷ヅ懦猓部上嗷マD換，從而使不同基因的轉錄態(tài)勢處于某種動態(tài)的平衡。在靜息或異染色質

38、區(qū)域，H3K9的甲基化與DNA的甲基化相關聯。 靶向H3K9 賴氨酸的酶是含SET結構域的Suv39h1. HDAC對H3K9的去乙酰化必須發(fā)生在該位點的甲基化之前。甲基化的H3K9會募集蛋白質HP1, 結合于H3K9me的HP1 則靶向激活DNA甲基轉移酶 (DNMTs), 使該處的DNA發(fā)生甲基化。在整個基因組的范圍內，標示出各DNA序列所處的染色質構型的表觀遺傳學標志，從而顯示出各基因的轉錄活性，就形成了表觀基因組。4,1,4 非編碼RNA近年來，繼在細菌中發(fā)現有小RNA (約50-200核苷酸) small RNA(sRNA)可調控靶基因的翻譯后，在大多數真核細胞內也發(fā)現有微小RNA

39、(MicroRNA, miRNA)能調控許多基因的轉錄。miRNA是約22個核苷酸的非編碼RNAs (non-coding RNAs)，能夠以序列特異性的方式，通過抑制轉錄產物的翻譯和促使mRNA降解的方式調控基因的表達。人類基因組中估計有1000多種基因編碼miRNAs參與細胞內的RNA干擾(RNAi) 而不編碼蛋白質。 其中約半數以編碼基因的內含子為模板產生，另一半來自長非編碼RNA (lncRNA)，有些miRNA甚至來自失活的假基因。此外，生殖細胞內有一類特殊的miRNA稱為piRNA (piwi-associated RNAs)。另一種在病毒感染時產生的siRNA (small in

40、terfering RNA), 兩者都能調控細胞內可移動元素的表達。miRNAs的生物合成過程主要分為兩個步驟：首先在細胞核內由編碼miRNA的基因為模板轉錄為初始轉錄本 (pri-miRNA), 其分子序列往往自我互補而自動折疊成雙鏈發(fā)夾結構。此分子在細胞核內被Drosha (一種RNase III超家族成員的內切酶) 切割成約70bp的前miRNA (pre-miRNA)后轉運出細胞核，到達細胞質內。第二步，再由Dicer酶催化切割成22bp的雙鏈RNA。這些短小的雙鏈RNA參與組成復合物RISC (RNA-induced silencing complex)，該復合物中的Argonaut

41、e (Ago) 家族蛋白可以最終將之加工成單鏈的miRNA，并投遞到其靶mRNA的3-UTR上發(fā)揮作用。作為一種公認的重要表遺傳機理，雖然它們并不影響DNA序列的改變，但對人類的健康生長發(fā)育和疾病的發(fā)生卻有著非常深遠的影響。據2007年8月發(fā)布的最新資料統計，目前在人類基因組中已被確認的miRNA序列已有500多種，并預測至少還有相同數量的miRNA序列有待證實。人類細胞中約有三分之一mRNA種類都受miRNA的負調控。在進化上miRNA比較保守，其分子莖部保守性更強，而環(huán)部可能存在突變。miRNA基因以單拷貝，多拷貝和集簇等形式排列在基因組中，絕大多數位于蛋白質編碼的基因間隔區(qū)，獨立轉錄，但

42、不翻譯成蛋白質，其表達水平有較強的組織特異性和時相性。miRNA一般不改變其作用靶mRNA的穩(wěn)定性，而通過抑制mRNA的翻譯而使基因沉默。 由于一般miRNA針對mRNA分子3端的非翻譯區(qū)形成互補，并不能完全封閉其翻譯，所以在表遺傳的層面上miRNA本身只以一種潛在的，非直接的方式同時調控許多基因的表達。miRNA有兩種方式降解和下調mRNA。如果兩者高度互補，則miRNA通過去除帽和polyA的尾而切割和降解mRNA。不過大多數情況miRNA與其互補序列結合得并不完全，因此僅能抑制靶mRNA的翻譯。4.2，轉錄因子功能的調控 轉錄因子的發(fā)現至今已逾20年，做為基因轉錄的反式元件，早先對轉錄因

43、子的一般概念是它含有兩種結構域: DNA結合結構域使之與DNA相連，激活或抑制結構域使之能調控轉錄。近年的研究對轉錄因子的認識又有顯著的深化和發(fā)展。例如，轉錄因子在缺乏DNA結合結構域時也可通過蛋白質之間的相互作用而與基因DNA上的啟動子結合。又如轉錄因子可同時含有激活和抑制結構域，而DNA結合結構域本身就可起轉錄調控結構域的作用。另一個重要概念是轉錄因子一般并非單獨起作用，而是多個轉錄因子通過相互作用，協同或組成復合物形式來調控轉錄。轉錄因子的作用需要其他蛋白質作為共活化或共抑制因子參與，而轉錄因子的功能本身也受一些小分子或其本身翻譯后的修飾所調控，這種調控可通過多渠道，并發(fā)生在多層面上。,

44、 轉錄活化和抑制結構域 (domain) 的作用機理 RNA聚合酶II對基因的轉錄需要在基因的啟動子上組裝通用性轉錄因子(general transcription factors GTFs) 來構成啟動前復合物 (preinitiation complex, PIC). 對大多數基因啟動子來說，開始由GTF-TFIID 與TATA盒結合。TFIID是一個多亞單位因子，由TATA結合蛋白（TBP）和TBP相關蛋白（TAFs）組成，再加入TFIIA, TFIIB，然后再結合上TFIIE, F, H 和RNA聚合酶II組成完整的PIC。不過，正常情況下似乎許多GTF還和其他因子與RNA聚合酶II共

45、同組成一個全酶 (holoenzyme).雖然不同方法提取的全酶的組分高度變化，但各種方法的全酶提取物中總含有幾種GTFs，包括SRB (suppressors of RNA polymerase B)和MED (MEDiator) proteins.所以PIC的組裝可能僅需要有限的因子，這些因子被認為對調控基因轉錄是最重要的。上述PIC足以在裸露的DNA模板上啟動轉錄，但在活細胞內DNA組裝成染色質，使PIC不易接近DNA。所以染色質結構必須經過重塑（見上述重塑機理）才使PIC得以與啟動子結合。轉錄效率被嚴格控制，例如在細胞有絲分裂時轉錄過程即停頓。此時轉錄機器被直接修飾，故影響到所有的基因

46、。還有些機制是全局性的，如Dr1是通用的轉錄抑制因子，它直接接觸TFIID，阻止TFIID 與TATA盒結合而使PIC不能組裝。更重要的是那些作用于特異基因啟動子相關序列元件而以基因特異性方式影響轉錄的調控因子。特定基因的轉錄過程包括一系列分子事件。其中有多處環(huán)節(jié)可被調控。例如染色質重塑，PIC在轉錄前的組裝，PIC的結合使DNA模板熔為單鏈并由RNA聚合酶II與啟動子結合，此后伴隨著核小體的重塑，PIC中的多種因子脫離而變成為延長轉錄的新的PIC。其間，TFIID始終保持與TATA盒的結合。延長轉錄的復合物也是被調控的靶點。轉錄調控因子可在上述所有環(huán)節(jié)上調控轉錄，某些可活化轉錄，某些抑制轉錄

47、。不過近來發(fā)現一些轉錄調控因子在不同的細胞環(huán)境下既可激活，也可抑制轉錄。 轉錄活化因子的活化結構域根據其氨基酸組成大致可分為幾類：一類如皰疹病毒VP16 蛋白和酵母GAL4蛋白中活化結構域那樣的酸性轉錄活化結構域，另有谷氨酸富集（如SP1）和脯氨酸富集(如CTF1)的兩類轉錄活化結構域。其中某幾組疏水的氨基酸殘基在上述三類轉錄活化結構域中都對其活性功能起關鍵作用。轉錄活化結構域怎樣發(fā)揮功能是基因表達的中心問題。轉錄活化因子的作用必須與染色質重塑過程相配合。幾種染色質重塑因子與轉錄活化結構域都相互作用。例如作為HATs的共活化因子p300/CBP與轉錄活化蛋白 CREB相互作用，也作用于 GTF

48、s。轉錄活化因子將p300/CBP拉至基因啟動子，同時也會拉住ATP依賴性染色質結構重塑復合物，使組蛋白乙酰化和染色質構型失穩(wěn)以便在該區(qū)域形成PIC。有證據表明轉錄活化因子能促進PIC的組裝。TFIID與TATA結合，作為PIC 組裝的第一步可能是轉錄活化因子作用的靶點，不過對此尚有爭議。位于同一個啟動子的多個轉錄活化因子總是協同激活轉錄，從而獲得大大超過預期的轉錄水平。這可能因為不同轉錄因子活化結構域可與PIC中各個成分接觸并相互作用，因而在PIC組裝的不同步驟都影響和促進了PIC的組裝。也有人認為TFIID中的TAFs與轉錄活化因子的協同作用有關。 大致有三種機制可使特異性的基因轉錄被抑制

49、：轉錄抑制因子可以阻止轉錄活化因子與啟動子相結合或著可以抑制結合于DNA上的轉錄活化因子蛋白的功能。第三種所謂“真正的抑制因子”是指含有的轉錄因子抑制結構域能阻止轉錄復合物的形成。例如Rb既能抑制與DNA結合的 E2F的活化結構域，又具有轉錄抑制結構域與 HDACs接觸，破壞PIC的組裝。一般認為轉錄抑制結構域含有疏水的堿性氨基酸，如富集丙氨酸。實際上也有抑制結構域富集脯氨酸的，如在Oct2 和WT-1抑癌蛋白分子中。Eve是一種在果蠅和哺乳動物細胞中的轉錄抑制因子。其功能不但需要丙氨酸富集區(qū)，也需要其自身結構域。體外實驗表明Eve阻止TFIID與TATA結合而影響PIC 的組裝。哺乳動物細胞

50、中另一轉錄抑制因子Msx-1也需通過其自身結構域與TBP的相互作用來抑制轉錄。轉錄抑制因子的作用一般不互相協同。這可能因為轉錄活化因子在PIC組裝的不同步驟都影響和促進了PIC的組裝而轉錄抑制因子只需破壞其中一個步驟即可。活化轉錄的負調控子復合物 (negative regulator of activated transcription，NAT) 也包含一組SRBs 和MEDs，其轉錄抑制功能在于SRB10/11異二聚體，它能在PIC組裝前磷酸化RNA聚合酶Pol II中的CTD，使Pol II失去功能而抑制轉錄。轉錄抑制因子的主要功能是使啟動子相關的染色質恢復受抑構型。它的抑制結構域作用于

51、幾種含HDAC活性的復合物而發(fā)揮作用。如NcoR (nuclear receptor corepressor) 和SMRT (silencing mediator for retinoic acid receptor and thyroid hormone receptor) 。這些復合物含有HDAC1/2 和Sin3共抑制因子。NuRD (neucleosome remodelling and histone deacetylase)復合物含有ATP依賴的核小體重塑活性SWI/SNF和HDAC1/2，也是抑制結構域的作用靶點。此復合物中還含有的MBD3蛋白具有與甲基化CpG結合的結構域，而與

52、甲基化DNA特異性結合的蛋白MeCP2也與HDAC復合物相連，進一步將DNA甲基化與HDAC活性在抑制轉錄方面的作用聯系起來。 幾種轉錄調控因子在不同的細胞內環(huán)境下既可激活轉錄也可抑制轉錄。例如果蠅細胞內的kruppel蛋白濃度增加時可從活化轉錄變成抑制轉錄。這與其從單體形式二聚化有關。WT1也是這樣。不僅與DNA直接結合的轉錄調控因子，某些共調控因子也有此特性。如Mdm2對P53是共抑制因子，對E2F卻是共激活因子。還有一些核激素受體在與配體結合后也會由抑制轉錄變成激活轉錄。它們未結合配體時與含有HDAC活性的NcoR/SMRT/SIN3共抑制復合物接觸. 當與激素配體結合后，它們脫離Nco

53、R/SMRT/Sin3共抑制復合物，轉而與含組蛋白乙?；富钚缘膒300/CBP或p/CAF復合物結合，從而激活轉錄。4.2.2, 磷酸化對轉錄因子功能的調控細胞外環(huán)境對細胞的刺激通過細胞內多種信號轉遞通路將信號送達細胞核內的DNA，調控基因的轉錄表達，使細胞從而做出相應的反應。這一調控主要是通過信號傳遞通路中一系列介質的磷酸化，最后作用于轉錄因子，使其轉錄活性發(fā)生快速的改變而實現的。因此，轉錄因子，轉錄共調節(jié)因子和染色質重塑因子如何受蛋白質磷酸化激酶作用而磷酸化，或受蛋白質磷酸酶作用而去磷酸化是這一調控的關鍵環(huán)節(jié)。這也為某些疾病中的治療性干預提供了可能的靶點。蛋白質的磷酸化或去磷酸化可以通過

54、以下至少5種機理來調控轉錄因子的功能：影響轉錄因子在細胞核內發(fā)揮作用的持續(xù)時間；影響轉錄因子受蛋白水解酶降解的難易程度；影響轉錄因子，共調節(jié)因子和基本轉錄復合物之間的相互作用；影響轉錄因子與DNA的結合；以及修飾染色質的空間構型。具體來說，轉錄因子的磷酸化/去磷酸化首先能決定轉錄因子在細胞內的位置。雖然許多轉錄因子原本就在細胞核內被磷酸化/去磷酸化，但有相當多的轉錄因子在細胞質和細胞核之間穿梭往來。它們在細胞內的位置取決于其蛋白分子上核定位信號（nuclear localization signal, NLSs）和核輸出信號（nuclear export signal, NESs）是否能被核轉

55、運機制的蛋白所識別。轉錄因子的磷酸化/去磷酸化會影響NLSs和NESs被核轉運機制蛋白的識別。例如在被激活的T淋巴細胞中，轉錄因子（NF-AT）的核漿穿梭就是受磷酸化/去磷酸化調控的。NF-AT被細胞質內鈣依賴性蛋白磷酸酶（Calcineurin）作用，在絲氨酸去磷酸化后，使NF-AT被輸入細胞核內。反之NF-AT可被某些蛋白磷酸化激酶（如MAPK）磷酸化后運出細胞核。磷酸化也可調控決定轉錄因子定位的調節(jié)蛋白的功能。如轉錄因子NF-k B異二聚體通常與其胞質錨定蛋白抑制分子lk B相結合，其NLS被遮蓋從而防止被轉位到細胞核內。當細胞對感染信號起反應時，lk B的NH2端兩處絲氨酸被lk B激

56、酶（IKK）復合物磷酸化，從而易被泛素化（ubiquitination）而快速降解。這時NF-k B分子上的NLS暴露出來并被識別，NF-k B異二聚體就能進入細胞核去發(fā)揮功能了。蛋白質的磷酸化/去磷酸化不但能調控轉錄激活因子，也能調控轉錄抑制因子在細胞內的定位。其次，磷酸化可使轉錄因子發(fā)生蛋白酶介導的降解。這種降解最典型的是由泛素(ubiquitin）通過一組酶（如E1, E2和 E3）與靶蛋白相連而實行的。泛素化的蛋白質接著被26S蛋白酶復合物降解。上述lk B/NF-k B是最為人了解的以磷酸化/去磷酸化所致的蛋白溶酶調控的轉錄因子。抑癌基因P53是另一個例子，作為轉錄因子，其磷酸化狀態(tài)

57、影響它被降解的命運。癌蛋白Mdm2與P53蛋白的NH2端相結合而抑制其轉錄活性，同時還起著E3泛素連接酶的作用，使P53被泛素介導的溶蛋白酶降解。當P53反轉錄區(qū)段的絲氨酸被磷酸化時，Mdm2與P53蛋白連接的親和力減低，使P53蛋白的穩(wěn)定性和轉錄活性增加。另一方面非活化的MAP蛋白激酶 JNK也與P53蛋白NH2端相結合介導泛素的蛋白溶酶降解作用。JNK的激活可使P53蛋白NH2端磷酸化,阻滯其與Mdm2的結合而使P53蛋白更穩(wěn)定。轉錄因子與共調節(jié)因子和基本轉錄復合物之間存在著相互作用，許多轉錄因子分子中存在磷酸化依賴性轉錄活化或轉錄抑制區(qū)域。這些區(qū)域的磷酸化可能直接阻擋轉錄因子與其他分子的

58、聯系或改變轉錄因子局部的空間構型，從而影響轉錄因子與共調節(jié)因子和基本轉錄復合物之間的親和力。蛋白質磷酸化還可直接調控共調節(jié)因子本身的活性。例如細胞受刺激時CREBP (cAMP-response element binding protein)在133位絲氨酸可被許多蛋白質激酶所磷酸化（如PKA, CaMKII及 MAPK等）。Ser-133的磷酸化使之能與CBP (CREB-binding Protein)和基本轉錄復合物相連，從而增加了轉錄活性。而CBP作為一種共活化因子，其本身也需要被PKA, CaMKIV及 MAPK磷酸化才具有轉錄活性。基本轉錄復合物 (basal transcrip

59、tional complex) 中的許多成分，如TFIID, TFIIF 和TFIIH都具有磷酸化激酶活性，它們在調控基本轉錄復合物的轉錄活性方面的功能尚不清楚。蛋白質磷酸化還能直接或間接地調控轉錄因子與DNA上啟動子的結合。許多轉錄因子的DNA結合區(qū)段呈堿性，而在此區(qū)段的磷酸化會引進負電荷而使之不能有效地與DNA結合。例如WT-1，作為一種含鋅指結構的轉錄抑制因子，被PKA磷酸化其鋅指區(qū)內的絲氨酸可抑制其與DNA結合的能力。雖然大多數轉錄因子的磷酸化會抑制其與DNA的結合，少數情況卻反而增進與DNA的結合。在遠離DNA結合區(qū)段處的磷酸化也會間接地調控轉錄因子與DNA的結合，例如STAT 和SMAD通路中的轉錄因子均需經磷酸化而寡聚合后，才能進入細胞核內與DNA相結合。近來的研究還表明染色質重塑復合物中修飾酶的活性也被其磷酸