菘藍(lán)葉片離體培養(yǎng)及植株再生

1、菘藍(lán)葉片的離體培養(yǎng)及植株再生 姓名：學(xué)號(hào)：指導(dǎo)老師：倪蘇 劉帆專(zhuān)業(yè)：學(xué)院：農(nóng)學(xué)院2013 年 7 月菘藍(lán)葉片的離體培養(yǎng)及植株再生 摘要：以菘藍(lán)幼嫩葉片為外植體，探討了不同外源激素種類(lèi)、組合及其不同濃度對(duì)菘藍(lán)葉片叢生芽誘導(dǎo)的影響，并完成了植株再生。結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加6-BA+NAA都能成功誘導(dǎo)出叢生芽；但當(dāng)添加激素為2,4D+KT時(shí)則不能誘導(dǎo)叢生芽，且在加入6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最好，為最佳誘導(dǎo)出芽培養(yǎng)基，并在添加MS+NAA1.0mg/L的生根培養(yǎng)基中長(zhǎng)出不定根。關(guān)鍵詞：菘藍(lán)；葉片離體培養(yǎng)；植株再生菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort.

2、)是十字花科菘藍(lán)屬二年生草本植物1，其干燥的根入藥稱(chēng)作板藍(lán)根，具有清熱解毒、涼血利咽之功效，用于治療盛豐感冒、發(fā)熱、頭痛、咽喉腫痛、扁桃體炎、急性腮腺炎、咳嗽痰多等多種生呼吸道感染疾病2，其葉片(大青葉)具有抗菌和清熱解毒的功效3，是常見(jiàn)的大宗藥材，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為滿(mǎn)足藥材市場(chǎng)對(duì)大量和優(yōu)質(zhì)的菘藍(lán)需求以及育種工作需求，菘藍(lán)的組培快繁技術(shù)體系顯得尤為重要，關(guān)于其組培快繁已有不少報(bào)道4-6，本試驗(yàn)的研究在前人的基礎(chǔ)上優(yōu)選了菘藍(lán)葉片離體培養(yǎng)基，旨在為低成本、快速高效的植株種苗生產(chǎn)提供技術(shù)前提，同時(shí)也為菘藍(lán)的優(yōu)質(zhì)育種、轉(zhuǎn)基因及遺傳研究等研究工作奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 供試材料 菘藍(lán)幼葉（由

3、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物生理學(xué)系提供）1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)如下：所有培養(yǎng)基均附加瓊脂5g/L、蔗糖30g/L，并調(diào)整PH至5.8，其中生根培養(yǎng)基另外加入0.2%的活性炭，每500mL培養(yǎng)基分裝于42支試管或10個(gè)玻璃瓶中，試管分成7支/包棉塞封口，捆扎，玻璃瓶用封口膜封口，培養(yǎng)基需要在高壓蒸汽滅菌鍋中121高溫濕熱滅菌20分鐘后放至常溫下備用。誘導(dǎo)培養(yǎng)基見(jiàn)表1，繼代培養(yǎng)基選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)中長(zhǎng)勢(shì)最好的一組；生根培養(yǎng)基設(shè)計(jì)見(jiàn)表2. 表1 不同激素組合誘導(dǎo)培養(yǎng)基序號(hào)不同激素組合誘導(dǎo)培養(yǎng)基1MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0

4、.5mg/L3MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L4 MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.5mg/L5 MS+2,4-D2.0mg/L+KT0.5mg/L6 MS+2,4-D4.0mg/L+KT0.5mg/L表2 不同激素組合生根培養(yǎng)基序號(hào)不同激素組合生根培養(yǎng)基1MS+NAA0.1mg/L2 MS+IBA0.1mg/L1.2.2 材料處理 菘藍(lán)植株提前一天噴施多菌靈800倍液預(yù)消毒，試驗(yàn)時(shí)剪下健康的先用洗滌劑漂洗后將葉片置于紗布中流水沖洗30min，再用75%酒精消毒10s，無(wú)菌水沖洗23次后，用0.1%升汞消毒8min，再用無(wú)菌水沖洗56次。1.2.3 接種在超凈工作臺(tái)上講

5、菘藍(lán)葉片切割成約1cm2大小的小片，并用滅菌的濾紙吸干葉片表面多余的水分，用滅好菌的鑷子將葉片塊正面向下接種到試管中，每管一小塊。1.2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)及數(shù)據(jù)記錄接種好的葉片暗培養(yǎng)7天，之后光培養(yǎng)，并每7天記錄各指標(biāo)（見(jiàn)表3），葉片放在20下培養(yǎng)，每天光照12h，強(qiáng)度約15002000lx。1.2.5 繼代光培養(yǎng)7天后選長(zhǎng)勢(shì)最好的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)；從試管中取出叢生芽并切分成小塊的單個(gè)的芽，接種到玻璃瓶中，每瓶4株，在同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.6 生根培養(yǎng)及煉苗移栽繼代培養(yǎng)7天后按表2的生根培養(yǎng)基設(shè)置接入培養(yǎng)生根，長(zhǎng)出完整根系的無(wú)菌苗拿到常溫下煉苗35天后，揭開(kāi)封口膜再煉苗3天左右，自來(lái)水洗凈苗上的

6、培養(yǎng)基，移栽至土壤中。移栽時(shí)苗床應(yīng)噴施多菌靈800倍稀釋液或稀高錳酸鉀溶液對(duì)苗床和幼苗消毒。2 結(jié)果與分析2.1 不同激素組合對(duì)菘藍(lán)誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響葉片接種后一周觀察記錄的指標(biāo)如表3所示，在光培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天后，各組菘藍(lán)葉片分化效果如圖1所示表3 暗培養(yǎng)7天后不同培養(yǎng)基組合啟動(dòng)效果觀察統(tǒng)計(jì)表序號(hào)接種數(shù)/個(gè)污染數(shù)/個(gè)污染率/%存活數(shù)/個(gè)存活率/%葉片形態(tài)變化真菌/個(gè)細(xì)菌/個(gè)真菌細(xì)菌134000034100%葉卷曲變小，增厚，有芽點(diǎn)23500003085.7%出芽，葉密集，卷曲，高度2-3cm34200004198%膨大,卷曲42700002696.3%膨大,增厚,卷曲537000037100%膨

7、大,卷曲62700002696.3%膨大,增厚圖1 光培養(yǎng)7天后各組培養(yǎng)基中菘藍(lán)葉片情況圖1中從右至左分別是16組培養(yǎng)基，其中13組有叢生芽分化，46組無(wú)叢生芽的分化，但多少都形成了愈傷組織，而3號(hào)培養(yǎng)基中芽分化最多，葉片長(zhǎng)而纖細(xì)，2號(hào)培養(yǎng)基數(shù)量適中但葉片較寬而短，1號(hào)培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況明顯不如2、3號(hào)。就總體而言，考慮到壯苗及形成在上植株，2號(hào)培養(yǎng)基的激素組合最優(yōu)。繼代培養(yǎng)時(shí)，總共接種叢生芽123株，壯苗結(jié)束后存活120株，其中有1株細(xì)菌污染，未存活的苗呈現(xiàn)玻璃化，分析可能是由于轉(zhuǎn)接時(shí)滅菌的鑷子未完全冷卻燙傷無(wú)菌苗使其玻璃化。2.2 不同激素對(duì)菘藍(lán)生根培養(yǎng)的影響生根培養(yǎng)7天后，只有接入1號(hào)培養(yǎng)基

8、的少量芽長(zhǎng)出零星不定根，即加入NAA的培養(yǎng)基有根的分化，2號(hào)培養(yǎng)基中沒(méi)有根的分化即加入IBA的培養(yǎng)基還沒(méi)有根的分化，且部分死亡。分析可能的原因是NAA能較好的促進(jìn)菘藍(lán)叢生芽生根，并完成植株再生，但也不排除由于試驗(yàn)操作的原因?qū)е铝藚采康乃劳鲆约芭囵B(yǎng)時(shí)間不夠植株還沒(méi)有開(kāi)始分化根，需要進(jìn)一步加長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)觀察。但由于時(shí)間限制，未能完成移栽試驗(yàn)。3 結(jié)論與討論3.1 結(jié)論試壓數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加6-BA+NAA都能成功誘導(dǎo)出叢生芽；但當(dāng)添加激素為2,4D+KT時(shí)則不能誘導(dǎo)叢生芽，且在加入6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最好，為最佳誘導(dǎo)出芽培養(yǎng)基，并在添加MS+N

9、AA1.0mg/L的生根培養(yǎng)基中長(zhǎng)出不定根，煉苗后移栽成活可完成植株再生，但由于時(shí)間限制未能完成移栽試驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)成活率，只能初步證明其植株再生是能夠成功的。3.2 討論 由試驗(yàn)結(jié)果可知，不同類(lèi)型的外源激素對(duì)菘藍(lán)葉片的誘導(dǎo)效果是不一樣的。2,4-D+KT的組合誘導(dǎo)離體葉片脫分化形成愈傷組織，而6-BA+NAA的組合則誘導(dǎo)離體葉片再分化形成叢生芽；而不同的外源激素共同存在的情況下，不同的濃度比則對(duì)叢生芽的分化影響程度不同，隨著NAA濃度的增加，叢生芽的數(shù)量在增加，BA的相對(duì)濃度開(kāi)始減小，促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖的能力自然減小，生長(zhǎng)素類(lèi)似物的作用開(kāi)始凸現(xiàn)出來(lái)，因此叢生芽的葉片會(huì)呈現(xiàn)長(zhǎng)而纖細(xì)的狀態(tài)。分裂素與生

10、長(zhǎng)素比值低時(shí)，葉組織薄壁細(xì)胞回復(fù)分裂能力，促進(jìn)不定根和側(cè)根的分化，相反其比值高時(shí)促進(jìn)不定芽的分化。參考文獻(xiàn)1 姚振生.藥用植物學(xué)M.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2003:2662 金玉松.板藍(lán)根的新用途J.開(kāi)卷有益.求醫(yī)問(wèn)藥,2003(5):32-333 陳秋芳,黃群策,秦廣雍.菘藍(lán)葉片離體培養(yǎng)與試管無(wú)性系的建立J.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)2007(7):98-1004 張麗瓊,周瓊,柳林,等.不同培養(yǎng)基對(duì)菘藍(lán)葉片組織培養(yǎng)的效應(yīng)J.廣西熱帶農(nóng)業(yè),2007(6):30-315 彭麗萍,張遠(yuǎn)兵,汪露潤(rùn).菘藍(lán)離體葉片高頻再生系的建立J.安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2007,21(4):14-176 苗永美,簡(jiǎn)興,石靜.菘藍(lán)兩種外植體愈傷組織誘導(dǎo)研究J.生物技