?；撬釋?duì)大鼠腦缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞凋亡的影響

1、    ?；撬釋?duì)大鼠腦缺血再灌注損傷時(shí) 細(xì)胞凋亡的影響        摘要目的：研究?；撬?taurine, Tau)對(duì)腦缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響。方法：建立大鼠全腦缺血再灌注模型，使用DNA片段原位末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotigyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)和流式細(xì)胞儀(flow cytometry, FCM)觀察了Tau治療后細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果：海馬及

2、頂葉皮層內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)顯著降低，但在1 mg及2 mg劑量組間無(wú)顯著差異。結(jié)論：Tau對(duì)腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能部分由于降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生。主題詞腦；局部缺血；?；撬?The effect of taurine on apoptosis during ischemia-reperfusion injury in ratsZHAO ShiFu,CAI Wen-Qin1Department of Neurology, Xin Qiao Hospital, Third Military Medical College, Chongqing(400037)1 Department of

3、Histology and Embryology, Thrid Military Medical CollegeAbstractAIM and METHOD:In order to recognize the effect of taurine on apoptosis during ischemia-reperfusion injury, the model of rat globle brain ischemia-reperfusion injury was made, the changes of apoptotic cells were observed after taurine t

4、reatment by using methods of terminal deoxynucleotigyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) and flow cytometry(FCM).RESULTS:The number of apoptotic cells decreased significantly in hippocampus and parietal cortex, but there were significant difference between 1 mg and 2 mg dose group.

5、 CONCLUSION:The neural protective effect of taurine against ischemia-reperfusion injury may be partially due to reducing occurrence of apoptosis.MeSHBrain; Ischemia; Taurine近年的研究提示細(xì)胞凋亡是腦缺血損傷的重要形式1。牛磺酸(taurine, Tau)是人體內(nèi)含量較高的自由氨基酸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要生理功能，是一種抑制性作用的氨基酸2。研究發(fā)現(xiàn)Tau對(duì)缺血、驚厥等引起的神經(jīng)元損害具有對(duì)抗作用2，3，這種抗損害作用是

6、通過(guò)對(duì)抗興奮性氨基酸、過(guò)氧化物和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平實(shí)現(xiàn)的，而興奮性氨基酸、過(guò)氧化物和細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高與細(xì)胞凋亡(apoptosis)的發(fā)生有關(guān)4，5。因此，Tau可能對(duì)缺血后細(xì)胞凋亡有一定影響。本研究通過(guò)建立全腦缺血模型，觀察Tau治療后細(xì)胞凋亡的變化，為腦缺血的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法1.大鼠腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停篧istar大鼠，體重250300 g，0.3%戊巴比妥鈉(ip)麻醉后，固定于立體定位儀上，使用四血管阻塞模型，先在第1、2頸椎水平閉合雙側(cè)椎動(dòng)脈，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。次日在乙醚麻醉下，用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血30 min，松開(kāi)微動(dòng)脈夾，進(jìn)行再灌流，達(dá)到再灌流時(shí)間后取材

7、。2.?；撬峤o藥方式及分組：采用腦室內(nèi)給藥，將大鼠固定于立體定位儀，顱頂保持在同一水平面，以前囟為零點(diǎn)，向后0.8 mm，外側(cè)1.5 mm，深4.5 mm，進(jìn)入腦室(右)后推藥時(shí)感阻力小。以1 mg及2 mg兩個(gè)劑量組，分別給以10%?；撬?Sigma)10 L和20 L，每組給藥兩次，于缺血前給1次，缺血再灌流12 h再給1次，對(duì)照組用相同體積的生理鹽水，每組5只，用于FCM測(cè)定；另外每組4只，用于TUNEL染色。3.TUNEL染色：使用德國(guó)BM公司原位末端標(biāo)記盒，原理是應(yīng)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT) 將熒光素標(biāo)記dUTP連接于DNA片段3-OH末端。切片經(jīng)蛋白酶K(20 mg/L,Si

8、gma)室溫下消化15 min，再用甲醇配制的0.3%H2O2處理30 min，然后浸于TUNEL反應(yīng)混合物中，37 60 min，用TB緩沖液(300 mmol/L NaCl, 30 mmol/L sodium citrate)室溫下孵育15 min終止反應(yīng)，再用連有辣根過(guò)氧化物酶(POD)的抗熒光素抗體于濕盒中37孵育30 min，DAB顯色。陰性對(duì)照采用標(biāo)記液(無(wú)TdT)代替TUNEL反應(yīng)混合物。4.FCM測(cè)定：于缺血再灌流24 h斷頭取腦，取給藥同側(cè)海馬分離單細(xì)胞6，固定后按TUNEL方法染色，F(xiàn)CM測(cè)定。5.像處理：使用德國(guó)Leica公司MD20像分析系統(tǒng)，測(cè)定單位面積(mm2)陽(yáng)性

9、細(xì)胞核數(shù)。結(jié)果1.FCM測(cè)定：通過(guò)缺血前給予1 mg和2 mg兩種劑量牛磺酸，于缺血再灌流24 h分離海馬單細(xì)胞，經(jīng)TUNEL熒光染色，對(duì)凋亡細(xì)胞數(shù)量、百分比及平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，生理鹽水對(duì)照組，凋亡細(xì)胞數(shù)為12.36%，1 mg治療組為8.93%，2 mg治療組為8.33%，治療組與生理鹽水對(duì)照組間有顯著差別(P0.05)，但兩種劑量之間無(wú)顯著差別(見(jiàn)表1)。表1牛磺酸對(duì)腦缺血再灌流損傷中海馬內(nèi)凋亡細(xì)胞的影響Tab 1 The effect of taurine on apoptosis in hippocampus during ischemia-reperfusion injuryCo

10、ntrol 1 mg2 mgNumber of apop1236±108893±251*833±143*%12.36±1.088.93±2.51*8.33±1.43*Fluo-density26.30±2.3425.00±2.5823.50±1.52     n=5,*P0.05，vs control2.TUNEL染色：在生理鹽水對(duì)照組，缺血再灌流24 h，海馬CA1區(qū)及頂葉皮層可見(jiàn)較多陽(yáng)性細(xì)胞核，表現(xiàn)為核固縮，陽(yáng)性信號(hào)局限在核內(nèi)，染色質(zhì)凝集，邊聚，形成半月?tīng)罨颦h(huán)狀

11、。1 mg及2 mg治療組，海馬及頂葉皮層陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。陽(yáng)性細(xì)胞核的計(jì)數(shù)顯示Tau治療組陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)較對(duì)照組明顯減少(見(jiàn)表2)，而兩組之間無(wú)顯著差別。表2牛磺酸治療后缺血再灌流24 h腦內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)的變化Tab 2 The changes of the number of apoptotic cells in brain at 24hof ischemia-reperfusion after taurine treatment (<"g393 (162 bytes)" src="/med/cano/201003/20100310191118172&qu

12、ot; 33 15>)RegionsControl1mg2mgCA118.43±2.0112.63±2.69*11.56±3.01*PC17.50±1.7611.69±2.95*10.44±2.10*     n=4;CA1:the sector of hippocampus; PC:parietal cortex; *P0.05，*P0.01, vs control討論近年，研究逐步證實(shí)細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌流損傷的重要形式之一，特別在遲發(fā)性神經(jīng)元損害階段1。在腦缺血后?；撬岷吭龈?，可對(duì)

13、抗谷氨酸(glutamate,Glu)等興奮性氨基酸及Ca2+升高引起的神經(jīng)元損傷3，7。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌流中，給予Tau后，海馬CA1區(qū)及頂葉皮層內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著降低，1 mg及2 mg治療組，頂葉皮層每平方毫米凋亡細(xì)胞數(shù)分別降至11.69及10.44個(gè)。FCM測(cè)定也顯示海馬內(nèi)凋亡細(xì)胞顯著下降，反映Tau對(duì)腦缺血再灌流細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有一定保護(hù)作用。以前對(duì)腦缺血后?；撬嶙兓难芯刻崾?，腦缺血后?；撬岷靠焖偕仙?，隨腦血流的增多，?；撬岷肯陆?，但再灌流4 h后其含量又上升，這種變化與缺血后神經(jīng)元的損傷的發(fā)生一致7。?；撬岬姆植荚谀X內(nèi)不同區(qū)域差別較大，主要分布于細(xì)胞內(nèi)，使用微灌注技術(shù)

14、測(cè)得細(xì)胞外液濃度，在缺血后含量可數(shù)百倍增加8，由于?；撬犭y以通過(guò)血腦屏障，本實(shí)驗(yàn)從腦室內(nèi)給藥，根據(jù)生理時(shí)含量及缺血后變化確定給予1 mg和2 mg兩種劑量，觀察細(xì)胞凋亡的發(fā)生變化，1 mg和2 mg治療組與對(duì)照組比較均有顯著性降低，而兩種劑量之間無(wú)顯著性區(qū)別?？赡芤?yàn)閷?shí)驗(yàn)中使用1 mg和2 mg，相對(duì)腦內(nèi)水平，均為大劑量，反映?；撬嵩趧┝窟_(dá)到一定程度后，再增加劑量，其作用上升不明顯。在培養(yǎng)細(xì)胞的研究中有類似結(jié)論，楊忠等9使用0.5-10 mmol/L不同濃度牛磺酸，觀察其對(duì)Glu和使君子酸(quisqualate,Qu)導(dǎo)致的培養(yǎng)小腦神經(jīng)元死亡的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)2.0 mmol/L時(shí)效果最佳，再增

15、加濃度其作用效果不再增強(qiáng)。體內(nèi)牛磺酸分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉及心臟內(nèi)，具有抑制神經(jīng)元過(guò)度興奮、抗驚厥和增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血的耐受性等廣泛的生理作用2，3。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，給予外源性Tau能降低腦缺血再灌注中細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此，外源Tau對(duì)防治腦缺血再灌流損傷是有益的。?；撬峤档腿毖俟嗔髦屑?xì)胞凋亡的機(jī)制尚未得到認(rèn)識(shí)，可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+、對(duì)抗興奮性氨基酸、超氧化物等作用有關(guān)。作者單位:趙士福第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(重慶 630037)蔡文琴第三軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室參考文獻(xiàn)1Nitatori T, Sato N, Waguri S, et al. Delayed neurona

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