斤拔黃酮抑制血栓形成機制研究

1、斤拔黃酮抑制血栓形成機制研究    【摘要】     目的 探索千斤拔黃酮抑制血栓形成及機制。方法 50只Wistar雄性大鼠隨機分為5組，分別為空白對照組(NC)、模型組(MC)、丹參組(SAM)、千斤拔黃酮高劑量組(FPH)和低劑量組(FPL)，每組10只。NC與MC組生理鹽水10 ml/kg灌胃;SAM組丹參液10 ml/kg(相當(dāng)于丹參生藥0.1 g/ml)灌胃;FPH組和FPL組按體重10 ml/kg(相當(dāng)于千斤拔生藥1.2 g/ml、0.3 g/ml)灌胃。各組連續(xù)灌胃7d，1次/d。末次灌胃

2、后除NC組外，其他各組大鼠制備股動脈血栓模型，并于模型制備后繼續(xù)灌胃7 d。第7天灌胃1 h后分別對各組大鼠腹主動脈采血，進(jìn)行血小板聚集率檢測，對MC組和FPH組分別用ELISA法進(jìn)行GMP140、tPA、PAI1含量測定。結(jié)果 FPH組與MC組比較，血小板聚集率均明顯降低(P<0.05，P<0.01);GMP140基本保持基礎(chǔ)水平，而MC組增高(P<0.05);tPA均有不同程度增高，但FPH組增高顯著(P<0.05)，F(xiàn)PH組血漿PAI1降低，MC組PAI1增高(P    【關(guān)鍵詞】  千斤拔黃酮;血小板聚集率;GM

3、P140;tPA;PAI1    以往研究表明，中藥活血化淤方案在預(yù)防和治療血栓性疾病中起重要作用，其機制是通過抗血小板聚集、抗凝血酶、降解纖維蛋白原、溶解纖維蛋白來實現(xiàn)的。千斤拔黃酮是天然的黃酮類化合物之一，本文通過千斤拔黃酮對血栓模型大鼠的血小板聚集率、血小板顆粒膜蛋白(GMP140)、組織型纖溶酶原激活劑(tPA)及I型纖溶酶原激活物抑制因子(PAI1)含量的影響，探討千斤拔黃酮對血栓形成的抑制作用及機制。1 材料與方法1.1 動物 Wistar雄性大鼠50只，體重為180250 g，均為雄性，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為空白對照組(NC)

4、、模型組(MC)、丹參組(SAM)、千斤拔高劑量組(FPH)和低劑量組(FPL)，每組10只。1.2 方法1.2.1 試劑與儀器 千斤拔水提物(提取條件按萃取優(yōu)化工藝進(jìn)行);二磷酸腺苷(ADP)，Sigma公司;丹參片(上海雷允上藥業(yè)有限公司，每片含生藥1 g);枸櫞酸鈉(分析純，北京化工廠);聚維酮碘溶液(吉林省明星醫(yī)用消毒藥械廠);注射用青霉素鈉(160萬U，華北制藥股份有限公司)。GMP140、tPA及PAI1含量測定(ELISA)全套試劑盒(上海太陽生物技術(shù)公司)。LBYNJ2全自動四通道血小板聚集儀LDZ52低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠);WFJ720B型可見分光光度計尤尼柯(上海)

5、儀器有限公司;光學(xué)顯微鏡(長春第一光學(xué)儀器廠)。超低溫冰箱MDF382ETECAN Sunrisebasic酶標(biāo)儀(奧地利)。1.2.2 實驗步驟 NC與MC組生理鹽水10 ml/kg灌胃;SAM組丹參液10 ml/kg(相當(dāng)于丹參生藥0.1 g/ml)灌胃;FPH和FPL組按體重10 ml/kg(相當(dāng)于千斤拔生藥1.2 g/ml、0.3 g/ml)灌胃。各組連續(xù)灌胃7 d，1次/d。末次灌胃后除NC組外，其他各組采用銀針鉗夾法制備動脈血栓模型。具體方法：將大鼠綁縛在大鼠固定臺上，用聚維酮碘消毒并備皮后，利多卡因0.5 ml/只注射于左后肢麻醉，切開左后肢表皮，分離股動脈，用鑷子剝離股動脈，將

6、銀針刺入股動脈血管，深度為10 mm，并用鑷子在刺有銀針的血管處從不同角度輕輕鉗夾，以造成血管內(nèi)膜損傷，然后拔出銀針，按壓止血，縫合切口并注射青霉素預(yù)防感染。并于模型制備后繼續(xù)灌胃7 d。第7天灌胃1 h后分別對各組大鼠腹主動脈采血。實驗前將MC組和FPH組大鼠經(jīng)右頸動脈采血0.9 ml，實驗后取腹主動脈血0.9 ml以2% EDTA Na2(血與抗凝劑之比為91)，3 000 r/min離心10 min，收集上層液，-80保存待測。1.2.3 檢測指標(biāo) 大鼠腹腔主動脈取血1 ml注入盛有3.8%枸櫞酸鈉溶液試管中(血與抗凝劑之比為9：1)輕輕搖勻，采用LBYNJ2血小板聚集儀，以1 500

7、r/min離心5 min，吸取上清液為富血小板血漿(PRP)，放置于8×8方形杯中置恒溫孔中備用;余血繼續(xù)以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液為貧血小板血漿(PPP)。取200 l PPP放入方形杯中用以調(diào)零，取200 l PRP加入盛有攪拌子的方形杯中，PPP調(diào)零后，取出PPP方形杯，放入PRP方形杯，待顯示血小板讀數(shù)后，加入終濃度為5×10-4mol/L ADP 11l可獲得1、3和5 min血小板聚集率(PAG)及最大血小板聚集率(MPAG)數(shù)值。采用經(jīng)典酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)定量測定MC組、FPH組實驗前后血漿GMP140、tPA及P

8、AI1含量。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗。2 結(jié) 果2.1 對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響 與NC組比較，MC組血小板聚集率明顯升高(P<0.01)，說明血栓造模成功。FPH與SAM組相比，血小板聚集率明顯下降(P<0.05);而FPL組僅有降低血小板聚集率的趨勢。表明千斤拔水提物高劑量具有較好的改善血液流變學(xué)的作用。見表1。2.2 對GMP140，tPA ，PAI1含量的影響 見表2。術(shù)后FPH組血漿GMP140基本保持基礎(chǔ)水平，MC組增高(P<0.05);術(shù)后兩組tPA均有不同程序的增高，但FPH組增高顯著，與MC組相比有顯著性差異(P<

9、;0.05)。術(shù)后FPH組血漿PAI1降低，對照組血漿PAI1增高(P3 討 論血小板活化產(chǎn)物GMP140是目前最具特異性血小板活化的分子標(biāo)志物，血漿中GMP140含量變化能反映體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)血小板活化程度及血栓傾向1。本研究中模型動物術(shù)后血漿GMP140水平顯著增高，說明血管損傷后，血小板明顯活化，千斤拔黃酮能有效抑制血管損傷后血小板活化。制約血塊形成的機制是纖維蛋白的溶解，在纖溶過程中，纖溶酶原及其活化型纖溶酶起著關(guān)鍵作用，纖溶酶原激活物中最主要是tPA和uPA。tPA激活纖溶酶原有纖維蛋白存在，參與纖溶調(diào)節(jié)的纖溶抑制物有多種，一類是直接抑制纖溶酶活性的纖溶酶抑制物，主要包括2AP和2MG;

10、另一類是通過抑制纖溶酶原激活物的活性，阻撓纖溶酶原活化為纖溶酶，從而對纖溶過程產(chǎn)生影響，已知PAI主要包括PAI1、PAI2、PAI3和PN。tPA和PAI1主要由內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞合成，是反映纖溶活性的兩個重要指標(biāo)，決定了纖溶活動強度。tPA的升高和PAI1的下降提示纖溶亢進(jìn)，本研究中FPH血漿tPA含量明顯高于對照組，PAI1含量低于對照組，說明千斤拔黃酮有促進(jìn)血管損傷后血漿纖溶活性作用。千斤拔為豆科植物千斤拔的根，性味甘辛、溫南寧市藥物志：“甘、平、無毒”，具有祛風(fēng)利濕，散瘀解毒之功。在金雞虎丸、壯腰健腎丸、千金片中都有千斤拔成份。黃酮是一類多酚類(polyphenols)化合物，在植

11、物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷，一部分以游離形式存在。研究證明從植物提取的黃酮類化合物有多種藥理作用，從不同植物提取的黃酮又各有其獨特藥理學(xué)特點;具有抗血小板聚集作用的類黃酮，研究發(fā)現(xiàn)金雀異黃素能夠阻滯血小板活化因子(PAF)刺激的血小板的聚集2;羥黃酮兒茶素等可降低氧化型LDLC和減少載脂蛋白有缺陷的大鼠動脈粥樣硬化形成3;黃酮的擴(kuò)張腦血管作用為黃酮類化合物具有鈣離子阻滯的機制而非刺激與內(nèi)皮有關(guān)的血管舒張作用。大豆甙元、玉米赤霉烯酮、鷹嘴豆芽素可作用于腦血管而使腦血管擴(kuò)張，異黃酮在擴(kuò)張大腦基底動脈內(nèi)經(jīng)同時內(nèi)源性的NO合成升高，調(diào)整腦動脈的反應(yīng)性4。Rendig等檢測紅葡萄酒、酒精內(nèi)主要黃酮類化合物

12、5羥黃酮，發(fā)現(xiàn)血管舒張作用是血管內(nèi)皮依賴性的，而不含黃酮的紅葡萄酒或乙醇在較高濃度下沒有類似作用5。研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張冠狀動脈另一種機制是黃酮的刺激細(xì)胞色素P450系統(tǒng)和降低氧化時產(chǎn)生的氧自由基6，黃酮類化合物在心肌缺血再灌注中保護(hù)冠心病缺血再灌注時損傷，可能與降低vWF、ET1和提高NO含量有關(guān)。葛根黃素可改善冠心病患者的胰島素抵抗及其纖維蛋白溶解活性異常，應(yīng)用葛根黃素治療后，冠心病患者空腹血糖水平降低，而胰島素水平升高，PAI1水平降低，tPA活性升高7。綜上，本研究通過千斤拔黃酮對其在抑制血栓形成及其機制進(jìn)行實驗性探討，通過實驗組與對照組血小板聚集率指標(biāo)的顯著性差異，表明千斤拔黃酮具有抑制血栓

13、形成的作用。通過對GMP140、tPA、PAI1血漿含量變化表明，千斤拔黃酮的抗栓機制為抑制血小板活化與促進(jìn)纖溶激活，為千斤拔黃酮在心腦血管疾病領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了科學(xué)論證。    【參考文獻(xiàn)】  1 Dunlop LC，Skinner MP，Bendall LJ，et al.Characterzation of GMP140(PSelectin) as a circulating plasma proteinJ.J Exp Med，1992;175:1147.2 Dhar A，Paul AK，Skukla SD.Plateletactivatin

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15、ice following consumption of red wine，or its polyphenols quercetin or catechin， is associated with reduced susceptibility of LDL to oxidation and aggregationJ.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997;17(11)：274452.4 Sobey CG，Weiler JM，Boujaoude ML，et al.Effect of shortterm phytoestrogen treatment in male rats on nitric oxidemediated reaponses of carotid and cerdbral arteries:comparison with 17betaestradiolJ.J Pharmacol Exp Ther，2004;310(1)：13540.5 Rendig SV，Symons JD，Longhurst JC，et al. Effects of red wine， alcohol， and quercetin on coronary resistance and conductance arteriesJ.J Cardiov