靶向survivin利用RNA干擾技術(shù)影響云南個舊肺鱗癌細(xì)胞

1、靶向survivin利用RNA干擾技術(shù)影響云南個舊肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC凋亡的初步研究         08-05-06 09:34:00     編輯：studa20                   作者：蔣鴻超 ，孫茂盛，趙丹，呂琳，孫強(qiáng)明，李鴻鈞【摘要】  目的 檢測云南個舊肺鱗

2、癌細(xì)胞株YTMLC細(xì)胞內(nèi)源凋亡抑制因子survivin基因的表達(dá)以及促進(jìn)YTMLC細(xì)胞凋亡的情況。方法 構(gòu)建和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2至YTMLC細(xì)胞株,通過免疫熒光和半定量RTPCR 檢測survivin 蛋白表達(dá)及mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化，并通過流式細(xì)胞儀使用PIAnnexin V雙染法檢測YTMLC細(xì)胞株的凋亡。結(jié)果 構(gòu)建的2種重組質(zhì)粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin 2均能明顯抑制survivin基因的表達(dá);應(yīng)用免疫熒光檢測survivin基因的表達(dá),轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pshRNAsurvivin1和pshRNAs

3、urvivin2的實(shí)驗(yàn)組survivin熒光強(qiáng)度明顯低于轉(zhuǎn)染空載體pGE1和pshRNAnegative非特異對照質(zhì)粒;通過半定量RTPCR 檢測到survivin基因mRNA轉(zhuǎn)錄明顯減少,抑制率為80.60%和70.09%;通過PI Annexin V 雙染法檢測YTMLC細(xì)胞的凋亡分別達(dá)（33.42±2.42）%（P<0.01）和（20.09±1.32）%（P<0.01）。結(jié)論 重組質(zhì)粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2 均可明顯抑制YTMLC細(xì)胞內(nèi)源survivin 的表達(dá)和mRNA 的轉(zhuǎn)錄均可并明顯促進(jìn)YTMLC細(xì)胞的凋亡,為

4、survivin 介導(dǎo)的腫瘤基因沉寂療法提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  siRNA云南個舊肺鱗癌細(xì)胞株YTMLCsurvivin 基因;質(zhì)粒;表達(dá)    Key words：siRNA; Yunnan Gejiu lung squamous carcinoma cells(YTMLC); survivin gene;Plasmid;Expression0引言    survivin 是一類僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的凋亡抑制因子(Inhibitor of apoptosis,IAP),在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用1。研究

5、表明,抑制survivin基因的表達(dá)可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而抑制腫瘤的生長2。本實(shí)驗(yàn)選擇和設(shè)計針對survivin編碼基因的siRNA靶序列,通過人工合成靶序列后構(gòu)建表達(dá)siRNA靶序列的載體，并轉(zhuǎn)染云南個舊肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC細(xì)胞,觀察siRNA 能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性survivin表達(dá)的沉默并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡增加,為腫瘤的基因沉寂療法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。    1材料和方法    1.1材料與試劑    1.1.1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞    siRNA表達(dá)質(zhì)粒pGE1 和非

6、特異對照質(zhì)粒pshRNAnegative 購自Stratagene公司;大腸桿菌SCS1購自Stratagene公司。云南個舊肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC細(xì)胞由本研究所保存。    1.1.2試劑    去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒和小量DNA切膠回收純化試劑盒，小量細(xì)胞總RNA快速抽提純化試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品；RTPCR 試劑盒為Fermentas產(chǎn)品；內(nèi)切酶、Taq酶、T4 DNA連接酶和DL2000 Marker購自TaKaRa 公司; 一抗為survivin兔IgG多抗(FL142)購自Santa Cruz 公司

7、；二抗為FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購自北京中杉金橋公司;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000 購自Invitrogen 公司; PIAnnexin V雙染試劑盒購自Immuntech公司;引物和寡聚核苷酸片段均由上海生工生物工程公司合成；DMSO、Tris堿和甘氨酸購自Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI1640購自Gibco/BRL公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。    1.2方法    1.2.1靶向survivin的siRNA表達(dá)載體的靶序列的選擇和合成  &#

8、160; 以人survivin（NM001168）為對象，根據(jù)RNA設(shè)計原則3和survivin編碼序列,利用Stratagene公司和Invitrogene公司的在線設(shè)計程序siRNA WizardTM 1.0分別設(shè)計19和29nt的DNA 片段各一,其中19nt的靶序列針對survivin的開放讀碼框的第387bp405bp,其序列為5GAA AGT GCG CCG TGC CAT C 3，而29nt的靶序列針對survivin的開放讀碼框的第248bp276bp，其序列為5GTT GCG CTT TCC TTT CTG TCA AGA AGC AG 3上述兩個侯選序列通過美國生物技術(shù)信息

9、中心（National Center for Biotechnology Information）同源序列檢索確定與其他基因家族沒有同源性后進(jìn)行載體構(gòu)建。根據(jù)上述結(jié)果分別合成兩對針對survivin編碼序列的正義和反義的寡聚核苷酸片段。具體序列如下：survivin1 siRNA (編碼基因387bp405bp),5 GAT CCC GAA AGT GCG CCG TGC CAT CTC AAG AGG ATG GCA CGG CGC ACT TTC TTT TTT 3（正義）和5CTA GAA AAA AGA AAG TGC GCC GTG CCA TCC TCT TGA GAT GGC A

10、CG CGC ACT TTC GG 3(反義) ; survivin2 siRNA (編碼基因248bp276bp),5GAT CCC GTT GCG CTT TCC TTT CTG TCA AGA AGC AGG AAG CTT GCT GCT TCT TGA CAG AAA GGA AAG CGC AAC TTT TTT 3(正義) 和5CTA GAA AAA AGT TGC GCT TTC CTT TCT GTC AAG AAG CAG CAA GCT TCC TGC TTC TTG ACA GAA AGG AAA GCG CAA CGG 3(反義) ; 合成的DNA 兩端設(shè)計有BamH

11、或Xba酶切位點(diǎn) (下劃線處)。    1.2.2靶向survivin的siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定    上述合成的正義和反義的寡聚核苷酸片段等比例混合后經(jīng)過93變性3min后退火30min得到雙鏈寡聚核苷酸片段，利用T4 DNA連接酶分別與經(jīng)BamH和Xba酶切并切膠回收純化后pGE1表達(dá)載體連接,構(gòu)建siRNA表達(dá)重組載體pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCS1，小提質(zhì)粒后通過PCR驗(yàn)證雙鏈寡聚核苷酸片段是否插入，PCR反應(yīng)上游引物為5 CGT CGA TTT TTG TG

12、A TGC TCG TCA G 3，而其下游引物為5GAA GCA TTT ATC AGG GTT ATT GTC TCA TG 3。反應(yīng)條件是：943min變性,9430s,5530s,721min 30個循環(huán)后,725min延伸，PCR產(chǎn)物使用4%瓊脂糖電泳檢測并進(jìn)行序列鑒定。    1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)    YTMLC細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%新生牛血清、100U/ ml 青霉素、100U/ ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,培養(yǎng)條件為37,CO2 飽和度為5%,定期觀察細(xì)胞生長情況,每23d用0.25%的胰酶消化,進(jìn)行傳代培養(yǎng)

13、。    1.2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞    應(yīng)用小量質(zhì)粒提取試劑盒,提取去內(nèi)毒素重組質(zhì)粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2 (具體操作過程見說明書),并使用OD值進(jìn)行DNA 定量。用Invitrogen 公司轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000將正常培養(yǎng)的YTMLC細(xì)胞至匯合度90%時，用0.25%胰酶消化,800r/ min 離心,含10%血清但無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液重懸,每孔加1×106個/ ml 的等量細(xì)胞到6 孔板中,置37培養(yǎng)。 待細(xì)胞生長到占培養(yǎng)孔底約80%90%時,培養(yǎng)

14、液換為無抗菌素含10%血清的RPMI1640,培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染載體按以下分:(1)脂質(zhì)體組;(2)空質(zhì)粒pGE1;(3)非特異對照組pshRNAnegative; (4) pshRNAsurvivin1; (5) pshRNAsurvivin2。于次日,根據(jù)以上分組,每孔除(1)組外均按總量為0.8g的質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染,具體操作詳見Invitrogen轉(zhuǎn)染試劑盒說明。置37培養(yǎng),46h后加入含15%血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置37培養(yǎng),轉(zhuǎn)染72 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。    1.2.5免疫熒光    轉(zhuǎn)染72h后，6孔板的各

15、孔細(xì)胞用PBS洗滌2次,4%多聚甲醛室溫固定30min,之后用3%BSA 37封閉2h，一抗為兔抗survivin (Santa Cruz,USA) 1500加入37孵育2h,二抗為FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）15000加入37孵育1h。FITC標(biāo)記的兔抗survivin 在熒光顯微鏡下(激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長520nm) 呈綠色,觀察熒光表達(dá)變化并照相。 隨機(jī)選擇5 個細(xì)胞區(qū)內(nèi)200 倍(20×10倍) 視野,計數(shù)綠色熒光細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù),計算綠色熒光細(xì)胞抑制率= 總細(xì)胞數(shù) 綠色熒光細(xì)胞數(shù) / 總細(xì)胞數(shù)×100 %。并對綠色熒光細(xì)胞抑制率作統(tǒng)計學(xué)分析。

16、60;   1.2.6半定量RTPCR    轉(zhuǎn)染72h后用0.25%的胰酶消化,分別收集各組細(xì)胞,PBS洗滌兩遍,按試劑盒說明分別提取各組細(xì)胞的總RNA，并使用OD值進(jìn)行總RNA定量。各組均按總量為1.2g的總RNA分別進(jìn)行RTPCR 反應(yīng)。RTPCR反應(yīng)體系中各組均同時做兩管，目的是分別各加入一對引物,第一對是內(nèi)源對照三磷酸甘油醛脫氫酶( GAPDH ) 基因的引物,即上游引物5CCA CCC ATG GCA  AAT TCC ATG GCA 3和下游引物5TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC 3，其PCR產(chǎn)物大小為598bp;第二對是被沉寂的目的基因的引物,即survivin 基因的引物，即上游引物5 ACG AGC CAG ACT TGG CCC AGT GTT 3和下游引物 5TCA ATC CAT GGC AGC CAG CTG CTC 3，其PCR產(chǎn)物大小為281bp。 兩管PCR的