虎杖白藜蘆醇與黃芪總黃酮合用抗Ⅱ型人皰疹病毒藥效分析

1、虎杖白藜蘆醇與黃芪總黃酮合用抗型人皰疹病毒藥效分析            【關(guān)鍵詞】  虎杖    【摘要】 目的  探討虎杖與黃芪組方抗人皰疹病毒（HSV）時，其有效成分白藜蘆醇與總黃酮之間的相互作用對藥效的影響。 方法  以阿昔洛韋（ACV）為陽性對照，采用空斑減數(shù)實驗，用中效作用原理對虎杖白藜蘆醇與黃芪總黃酮合用抗型人皰疹病毒HSV-2333株的藥效進行了分析。 結(jié)果  在Hep-2細胞系統(tǒng)

2、中，ACV對HSV-2333株增殖抑制的ED50為10.85g/ml。當虎杖白藜蘆醇與總黃酮以1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮的比例合用時，對HSV-2333株直接殺滅、感染阻斷、增殖抑制的ED50依次為0.91g/ml，1.12g/ml，0.77g/ml;合用指數(shù)（Combination Index，TI）均<1.0，P<0.0005，說明這一合用比藥效最強，協(xié)同作用最明顯。 結(jié)論 ACV對HSV-2333株增殖抑制的治療指數(shù)（Treatment Indices，TIS）為100。1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮對HSV-2333株直接殺滅、感染阻斷、增殖抑制的TIs為1

3、25.5，102.0，148.3，為最佳合用比。     關(guān)鍵詞  虎杖白藜蘆醇 黃芪總黃酮 型人皰疹病毒333株       The effect analysis of antiherpes simplex virus type-2strain333with combination of resveratol of Rhizoma polygoni cuspidati and total flavonoids of Astragalus membranaceus 

4、0;    Wang Zhijie，Huang Qishan     Virus Research Institute，Medical College of Wuhan University，Wuhan430071.    【Abstract】 Objective In order to exploit the influence which was produced by the interaction between the ef-fective components resveratol

5、and total flavonoids on efficiency of antiHSV-2strain333，when an antiHSV medicinal Chinese herbs preparations was made up using Rhizoma polygoni cuspidati and Astragalus membranaceus，we carried out this research.Methods ACV was used as positive control，through plaque reduction assays，analyzed the co

6、mbi-nation effects between resveratol and total flavonoids on HSV-2strain333usingMedian Effect Principle.Results In Hep-2cell systems，the median effect dose（ED50）of ACV of reproduction inhibition to HSV-2strain333was10.85g/ml.When resveratol was combined with total flavonoids at1（Dm）resveratol/1（Dm）

7、total flavonoids，the ED50s of direct virucidal activity，the infection blockage and reproduction inhibition to HSV-2strain333were0.91g/ml，1.12g/ml，0.77g/ml respectively;the combination indices were all<1.0，and the relevant coefficients of Median Effect Equations of this ratio were all0.99，P &

8、#160;  Key words resveratol of Rhizoma polygoni cuspidati total flavonoids of Astragalus membranaceus HSV-2strain333       型人皰疹病毒（HSV-2）可引起生殖道皰疹、子宮內(nèi)膜炎等疾病，又是宮頸癌的協(xié)同誘因。HSV還可引起腦炎、腦膜炎 1 ，有HSV-2原發(fā)感染的孕婦有可能發(fā)生母嬰傳播 2 ，引起新生兒腦炎、全身播散性感染等，從而導(dǎo)致 3 偏癱、智力發(fā)育遲緩（P<0.05）;經(jīng)顱多普勒檢查異常（P=

9、0.034）及腦干聽覺誘導(dǎo)異常（P=0.023）。在HSV感染早期，HSV就在感覺神經(jīng)節(jié)建立了潛伏感染。臨床上首選藥物為阿昔洛韋（ACV）。在艾滋病患者或骨髓移植的受者，HSV的去氧胸腺嘧啶激酶基因容易發(fā)生突變，對ACV產(chǎn)生抗性。國外進行臨床實驗的HSV-2糖蛋白D和B重組疫苗對人類反復(fù)發(fā)作的生殖道皰疹沒有作用 4 ，HSV-1亞單位疫苗 5（Skinner疫苗）雖可使女患者生殖道皰疹復(fù)發(fā)率降低，但是結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)意義。HSV又因為有34.5蛋白 6 和ICP0蛋白 7 ，對IFN-、IFN-有抗性。研究開發(fā)抗HSV的新藥，始終都是醫(yī)藥工作者的重要任務(wù)，因此我們進行了抗HSV復(fù)方中藥的研究?；?/p>

10、杖白藜蘆醇（晶）是虎杖抗HSV-1株和HSV-2333株的有效成分之一 8，9 ，黃芪總黃酮是黃芪抗HSV-2的主要有效成分 10，11 。我們曾用中效作用原理對虎杖與黃芪合用抗HSV-1 12 、HSV-2 13 的藥效進行了比較分析，為了探討虎杖白藜蘆醇與黃芪總黃酮之間的相互作用對組方時藥效的影響，我們進行了此項研究?，F(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下。 1 材料與方法 1.1 材料    1.1.1 中藥 虎杖、黃芪由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院中南醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)中南醫(yī)院中醫(yī)科方學(xué)韞、魯遂榮教授鑒定為虎杖（Rhizoma polygoni cuspidati）和膜夾黃芪Astrag

11、alus mem-branaceus（Fisch）Bunge A。虎杖用水提醇沉法處理，水液用苯萃取后，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯至浸膏，用稀乙醇溶解，反復(fù)精制，得深棕色粉末狀物質(zhì)。這種抽提物易溶于水，Borntrager反應(yīng)和Molish反應(yīng)陽性，經(jīng)過對這種抽提物進行溴化鉀壓片紅外光譜的觀察，證明此化合物具有蒽醌結(jié)構(gòu)。同時對此化合物進行的質(zhì)譜、高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）分析，所得結(jié)果與曾里 14 和陳雷 15 等的結(jié)果一致，證實此化合物是白藜蘆醇（3，4，5-三羥基二苯乙烯）。黃芪總黃酮的提取基本上按照侯云德等的方法 16，即將黃芪水煎液經(jīng)水提醇沉

12、法處理后，水溶液過聚酰胺柱，留柱物用乙醇洗至基本無色，洗脫物減壓濃縮，室溫放置干燥得黃芪總黃酮提取物。此提取液在可見光下無色，在UV光下呈紫色。將其噴在濾紙上干燥后，暴露于氨蒸氣中，可見光下無色，UV光下紫色。如果噴刷碳酸鈉，顯灰綠色。黃芪總黃酮提取物與三氯化鋁反應(yīng)，可見光下無色，UV光下顯黃綠色熒光;與濃硫酸反應(yīng)，顯黃色;與鎂粉及濃鹽酸反應(yīng)顯黃色。這兩種提取物在-20放置3年之久，理化性質(zhì)穩(wěn)定，用空斑減數(shù)實驗證實，其生物學(xué)活性不變。用含10%二甲基亞砜（DMSO）的PBS配制濃度依次為10000g/ml，430.3g/ml的虎杖白藜蘆醇、黃芪總黃酮母液，G6漏斗過濾，分裝，待用。 

13、   1.1.2 ACV 批號為980751-3（麗珠集團湖北科益藥業(yè)有限公司）。    1.1.3 細胞和病毒 Hep-2細胞是人喉癌細胞株，購自武漢大學(xué)細胞保藏中心。HSV-2333株由本所保存。按本所常規(guī)培養(yǎng)細胞，繁殖病毒，HSV-2333株TCID50為10 -9 /0.1ml。1.2 方法    1.2.1 空斑減數(shù)實驗 本實驗采用的實驗方法基本上與文獻 13 相同。所有抗HSV-2實驗均以ACV為陽性對照，設(shè)置正常細胞對照以及單用病毒感染實驗時加入等體積含10%DMSO的PBS的陰性對照。實驗以三種方式

14、進行:（1）藥物對HSV-2的直接殺滅作用:病毒懸液與含藥培養(yǎng)液37孵育1h，感染細胞。（2）藥物對HSV-2感染細胞的阻斷作用:以含藥培養(yǎng)液預(yù)先與細胞在37孵育2h，再以HSV-2感染細胞。（3）藥物對HSV-2增殖的抑制作用:先以HSV-2感染細胞，再以含藥培養(yǎng)液孵育。每步操作后均以培養(yǎng)液將細胞洗3次。所用感染復(fù)數(shù)均為每個細胞1個空斑形成單位（Plaque forming unit，Pfu）。經(jīng)過上述處理的細胞加入細胞維持液（含0.5%羧甲基纖維素），觀察48h，用10%甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，計算空斑?？瞻邷p數(shù)率（%）=（病毒對照組空斑數(shù)-藥物處理組空斑數(shù)）/（病毒對照組空斑數(shù)）&

15、#215;100%。    1.2.2 藥物合用的實驗設(shè)計 按韓銳主編的腫瘤化學(xué)預(yù)防及藥物治療一書中的方法進行 17 。即以三種藥物合用比例，2（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮;1（Dm）白藜蘆醇/1 （Dm）總黃酮;1（Dm）白藜蘆醇/2（Dm）總黃酮進行HSV-2的空斑減數(shù)實驗，每種比例采用以上所述的三種實驗方式進行。    1.2.3 細胞毒性實驗 長成單層的Hep-2細胞，以含10（Dm）100（Dm）濃度的白藜蘆醇、總黃酮加入細胞生長液，加到Hep-2細胞上37孵育72h，以臺盼藍拒染法計數(shù)死活細胞數(shù)。 

16、0;  1.3 統(tǒng)計學(xué)方法    1.3.1 藥效的ED50和細胞毒IC50的計算 采用加權(quán)直線回歸法。    1.3.2 合用結(jié)果評判 根據(jù)Chou和Talalay導(dǎo)出的多種藥物效量公式:fa/fu=（D/Dm） m 及合用指數(shù)方法 18 。上式中fa和fu各代表系統(tǒng)中反應(yīng)及未反應(yīng)部分，D是劑量，Dm代表產(chǎn)生中效作用的劑量（ED50）。如果上式的兩邊采用對數(shù)，則可用統(tǒng)計學(xué)是直線回歸的方法作出中效作用圖，可以計算出產(chǎn)生不同空斑減數(shù)率（fa）所需的藥物濃度，求合用指數(shù)（Combination Index，CI）。對于相互不排斥

17、的藥物，CI=（D）1/（Dx）1+（D）2/（Dx）2。對于相互排斥的藥物，CI=（D）1/（Dx）1+（D）2/（Dx）2+（D）1（D）2/（Dx）1（Dx）2。其中（Dx）1、（Dx）2分別是第1種和第2種藥物單用時產(chǎn)生某一fa數(shù)值時的劑量，（D）1、（D）2則是這兩種藥物合用時產(chǎn)生相同fa數(shù)值時其中所含第1種及第2種藥物的劑量。CI<1.0，表示協(xié)同;CI=1.0，表示相加;CI>1.0，表示拮抗。 2 結(jié)果     2.1 虎杖白藜蘆醇與黃芪總黃酮合用對HSV-2333株的直接殺滅作用 見表1、表2、表3。從表1可見，白藜蘆醇與黃

18、芪總黃酮合用的ED50及ED90比兩種藥物單用時小，說明合用比單用藥效好。其中以1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮的ED50及ED90最小，藥效最好。從表2可見，三種合用比的合用指數(shù)（CI）均<1.0，證實白藜蘆醇與總黃酮合用有明顯的協(xié)同的直接殺滅作用，仍以1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮CI最小，協(xié)同作用最明顯。從表3可見，三種合用比中效方程的相關(guān)系數(shù)均為0.99，P<0.0005，說明這些結(jié)果差異具有非常顯著性。    2.2 虎杖白藜蘆醇與黃芪總黃酮合用時對HSV-2333株的感染阻斷作用 見表1、表2、表3。從表1可見，白藜蘆醇與黃芪總黃

19、酮合用的ED50及ED90比兩種藥物單用時小，這些結(jié)果提示合用比單用藥效好。從表2可見，三種合用比的合用指數(shù)（CI）均<1.0，證實白藜蘆醇與總黃酮合用對HSV-2333株有顯著協(xié)同的感染阻斷作用。重要的是，1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮的ED50及ED90最小，CI最小，藥效最好，協(xié)同作用最明顯。從表3可見，三種合用比中效方程的相關(guān)系數(shù)均為0.99，P<0.0005，差異具有非常顯著性。    2.3 虎杖白藜蘆醇與黃芪總黃酮合用時對HSV-2333株增殖的抑制作用 見表1、表2、表3。從表1可見，白藜蘆醇與總黃酮合用時的ED50及ED90比A

20、CV及兩種藥物單用時的ED50及ED90小，因此合用比單用藥效好。從表2可見，三種合用比的CI均<1.0，提示兩種藥物合用時對HSV-2333株的增殖具有顯著協(xié)同的抑制作用。仍以1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮的ED50、ED90、CI最小，藥效最好，協(xié)同作用最明顯。從表3可見，三種合用比中效方程的相關(guān)系數(shù)均為0.99，P<0.0005，差異具有顯著性。 表1 白藜蘆醇與總黃酮合用抗HSV-2333株的ED20ED90數(shù)值（略）     表1列出了在直接殺滅、感染阻斷、增殖抑制三種實驗中，白藜蘆醇、總黃酮單用及以三種不同比例合用時產(chǎn)生20

21、%、40%、50%、60%、80%、90%空斑減數(shù)率的用藥量，稱為ED20、ED40、ED50、ED60、ED80、ED90，單位為g/ml。     表2 白藜蘆醇與總黃酮合用產(chǎn)生20%90%空斑減數(shù)率時的合用指數(shù)（略）     表2列出了白藜蘆醇與總黃酮以三種比例合用時，產(chǎn)生20%、40%、50%、60%、80%、90%空斑減數(shù)率時的合用指數(shù)（CI）。上排是假定白藜蘆醇與總黃酮相互不排斥的CI值;下排是假定白藜蘆醇與總黃酮相互排斥時的CI值。 表3 白藜蘆醇與總黃酮合用抗HSV-2333株的中效方程參數(shù)（略）&

22、#160;    注: P<0.0005     2.4 虎杖白藜蘆醇與黃芪總黃酮合用的細胞毒作用 ACV對Hep-2細胞的細胞毒IC50為1085g/ml。白藜蘆醇的IC50為336.8g/ml?？傸S酮的IC50為161.4g/ml。2（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮的IC50為174.6g/ml;1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮的IC50為114.2g/ml;1（Dm）白藜蘆醇/2（Dm）總黃酮的IC50為137.8g/ml。     3 討論 從表1、表2、表3的結(jié)果

23、可以得出以下結(jié)論:（1）白藜蘆醇與總黃酮合用比單用抗HSV-2333株藥效好;（2）白藜蘆醇與總黃酮合用對HSV-2333株有協(xié)同的直接殺滅、感染阻斷、增殖抑制作用。以1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮的藥效最好，協(xié)同作用最明顯;（3）這些結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。    治療指數(shù)（Treatment Indices，TIs）=ED50/IC50。ACV對HSV-2333株增殖抑制的TI為100。如果按直接殺滅、感染阻斷、增殖抑制的順序排列，白藜蘆醇的TIs為137.5，109.3，86.8;總黃酮的TIs為33，59，46;2（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮的TI

24、s為94.4，98.6，65.9;1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮的TIs為125.5，102.0，148.3;1（Dm）白藜蘆醇/2（Dm）總黃酮的TIs為74.9，48.7，115.8。與ACV、白藜蘆醇、總黃酮的TIs比較，1（Dm）白藜蘆醇/1（Dm）總黃酮是最好的合用比。      參考文獻     1 Chu K，Kang DW，Lee JJ，et al.A typical brainstem encephalitis caused by herpes simplex virus.Arch

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