蒲公英總黃酮的提取及其抑菌性能

1、第 35卷 第 8期 東 北 林 業(yè) 大 學 學 報 Vol . 35No . 82007 8JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug . 2007蒲公英總黃酮的提取及其抑菌性能谷肄靜 王立娟(生物質材料科學與技術教育部重點實驗室 (東北林業(yè)大學 , 哈爾濱 , 150040 摘 要 研究了蒲公英總黃酮的提取條件及其抑菌性能 , 考查了乙醇質量分數 、 料液比 、 提取溫度 、 提取時間 和提取次數等因素對蒲公英總黃酮提取效果的影響 , 并在單因素試驗基礎上進行了正交實驗以確定最佳的提取條 件 。 試驗結果表明 , 蒲公英總黃酮的最

2、佳提取條件為 :以 40%乙醇為提取劑 , 在 70 、 料液比 1 20條件下提取 4次 , 每次提取時間 30min, 蒲公英粗總黃酮的提取率為 17. 51%(以蘆丁計 。 最佳提取條件下 , 相對標準偏差為 0. 41%, 說明試驗重復性很好 。 利用蒲公英總黃酮對黑曲霉 、 宛氏擬青霉 、 釀酒酵母和枯草桿菌進行了抑菌試驗研究 。 結 果表明 , 0. 43g/L(以蘆丁計 對釀酒酵母具有一 定的抑菌作用 , 而對黑曲霉沒有抑菌作用 。關鍵詞 蒲公英 ; 總黃酮 ; 提取條件 ; 抑菌性能分類號 R285. 5Extracti on of Tot a l Fl avono i ds

3、fro m m mance /Gu Yijing, W ang L ijuan (Key Laborat ory of i 2(Forestry University , M inistry of Educa 2 ti on, Harbin Forestry University . -2007, 35(8 . -4345An experi m t study the extracti on conditi ons of t otal flavonoids fr om Taraxacum m ongolicum and its bacteri ostatic perfor The of eth

4、anol volu me fracti on, rati o of material t o liquid, te mperature, extracting ti m e and extracting ti m es on extracti on effect of t otal flavonoids fr om T . m ongolicum were discussed . The op ti m u m extracti on conditi ons of t otal flavonoids by using orthogonal experi m ent based on singl

5、e fact or were obtained as ethanol s olvent 40%, rati o of material t o liquid 1 20, extracti on at 70degree C for 4ti m es and 30m in for each ti m e . Yield of rude t otal fla 2 vonoids is 17. 51%(as rutin . Relative standard deviati on is 0. 41%under the op ti m u m conditi ons, which indicates a

6、 good repeatability . Bacteri ostatic perf or mances against A spergillus niger , Pacelio m yces variotii bainier , Saccharo m yces cere 2 visiae and B acillus subtilis for t otal flavonoids fr om T . m ongolicum were measured res pectively . Results show that the t otal flavonoids have str onger in

7、hibiti ons on P . variotii bainier and B. subtilis , and inhibit S. cerevisiae t o s ome extent, but have no inhibiti on on B. subtilis under a concentrati on of 0. 43g/L.Key words Taraxacum m ongolicum ; Total flavonoids; Extracti on conditi ons; Bacteri ostatic perf or mances 蒲公英是一種常見的藥食兩用植物 , 其提取

8、物的抑菌研 究主要針對于金黃色葡萄球菌 、 變形桿菌 、 大腸桿菌 、 綠膿桿 菌等細菌方面 , 在國內未見有關對霉菌的抑菌研究報道 1-4。 另外 , 針對蒲公英總黃酮的研究很少 , 尚未見與蒲公英中總黃 酮提取條件及其抑菌方面相關的研究 。 本研究針對蒲公英總 黃酮提取條件進行探討 , 并考察其對 4種菌的抑菌性能 , 旨在 開發(fā)出一種全新的天然抑菌劑 。因為 , 目前常用的防腐劑大 多都為合成的化學物質 , 毒性較大 , 長期使用 , 危害人體健康 。 本研究還將為蒲公英的深加工及綜合利用開辟新的途徑 。 1 材料與方法1. 1 材料及試劑試驗用蒲公英 (Taraxacum m ongo

9、licum 為 2004年秋采自 東北林業(yè)大學校園 ; 蘆丁標準品 (美國 Sig ma 公司 ; 無水乙 醇 、 硝酸鋁 、 亞硝酸鈉 、 氫氧化鈉等化學試劑均為分析純 。 試驗用菌為黑曲霉 (A sp . niger 、 宛氏擬青霉 (B aeclio m y 2 ces variotii Bainier 和釀酒酵母 (Sac . cerevisiae , 均購于廣州 微生物研究所 ; 枯草桿菌 (B ac . subtilis 為自行分離 ; 培養(yǎng)基 為察式培養(yǎng)基 、 馬鈴薯培養(yǎng)基 (P DA 和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 。 試驗儀器和設備有 :可見分光光度計 (722型 、 水浴鍋 、 旋轉

10、蒸發(fā)器 、 手提式壓力蒸汽滅菌器 、 潔凈工作臺 、 恒溫培養(yǎng) 箱 、 電子天平等 。1. 2 試驗方法1. 2. 1 蒲公英總黃酮的提取蒲公英干粉 (1g 溶劑提取 過濾 濾液 測定總黃第一作者簡介 :谷肄靜 , 女 , 1979年 7月生 , 東北林業(yè)大學材料科 學與工程學院 , 在讀碩士研究生。通訊作者 :王立娟 。收稿日期 :2006年 9月 28日。責任編輯 :戴芳天 。 酮并計算提取率 。1. 2. 2 蒲公英總黃酮的測定 標準曲線 :精密量取蘆丁標準液 0、 1、 2、 3、 4、 5mL, 分 別置于 10mL 的容量瓶中 , 各加 30%的乙醇至 5mL; 然后分 別加入 5

11、%亞硝酸鈉溶液 0. 3mL, 搖勻 , 放置 6m in 。各加 10%的硝酸鋁溶液 0. 3mL, 搖勻 , 放置 6m in; 再各加 1mol/L的氫氧化鈉溶液 4mL, 最后分別用蒸餾水稀釋至 10mL, 搖 勻 , 放置 15m in, 在 510n m 測定吸光度 5。以蘆丁質量濃度 為橫坐標 , 吸光度為縱坐標繪制標準曲線 , y =0. 9044x -0. 01, R 2=0. 9982。 樣品的測定 :提取后過濾 , 取濾液 1mL, 加蒸餾水稀釋 100倍 , 測出吸光度 。 根據標準曲線可以測出樣品中總黃酮 的量 (以蘆丁計 。 提取率計算 :利用蒲公英總黃酮的提取率來

12、評價提取 效果 , 其計算式如下 :提取率 =(總黃酮質量 /蒲公英質量 ×100%。1. 2. 3 抑菌試驗分別配制察式培養(yǎng)基 、 馬鈴薯培養(yǎng)基 (P DA 、 牛肉膏蛋白 胨培養(yǎng)基 。 用察式培養(yǎng)基培養(yǎng)黑曲霉 , P DA 培養(yǎng)基培養(yǎng)宛氏 擬青霉和釀酒酵母 , 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草桿菌 。選 擇培養(yǎng) 4d 生長旺盛的試管斜面菌種 , 用滅好菌的移液管量 取 3mL 生理鹽水 , 加入菌種試管 , 充分搖勻全部倒入另一只 含有玻璃珠的 9mL 生理鹽水的試管中 , 充分震蕩 ; 玻璃珠將 從斜面培養(yǎng)基上溶下的孢子完全打開 , 制作菌懸液 。 將 1mL 質量濃度為 0. 43

13、g/L(以蘆丁計 的蒲公英粗總黃酮溶液均 勻涂于事先鋪好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中 ; 然后將菌懸液定量涂于 涂有蒲公英總黃酮的培養(yǎng)基表面 , 同時做空白試驗 。 28 下 恒濕培養(yǎng) , 定時觀察 , 并對比分析結果 。2 提取條件對提取率的影響乙醇質量分數對提取率的影響 :以料液比為 1 15加入不同質量分數的乙醇 , 60 提取 1次 , 時間 1h 。 乙醇質量分數 對提取效果的影響見表 1。乙醇質量分數從 10%增至 30%, 提取率變化不大 ; 質量分數由 30%到 40%, 提取率大幅度增 加 ; 乙醇質量分數大于 40%以后 , 提取率逐漸減小 。因此 , 40%乙醇對蒲公英總黃酮的提取率

14、較高 , 提取效果最好 。 表 1 乙醇質量分數對提取率的影響 % 乙醇質量分數 提取率 乙醇質量分數 提取率106. 44506. 96 306. 56606. 26 407. 10705. 96 料液比對提取率的影響 :分別以不同料液比加入 40%乙 醇 , 60 提取 1次 , 時間為 45m in 。 料液比對提取效果的影響 見表 2。 料液比由 1. 0 10. 0增加至 1. 0 17. 5, 提取率呈緩慢上 升趨勢 ; 當料液比為 1. 0 17. 5時提取率為 8. 53%, 達到最大 。 但當料液比大于 1. 0 17. 5后 , 提取率反而有所下降 ; 因為料 液比為 1.

15、 0 17. 5時 ,物 。 料液比增大 , ,較大的誤差 。 17.表 2料液比 (g mL 提取率 料液比 (g mL 提取率 /% 1. 0 7. 55. 741. 0 17. 58. 53 1. 0 10. 05. 141. 0 20. 05. 54 1. 0 12. 55. 431. 0 22. 56. 03 1. 0 15. 07. 00 提取時間對提取率的影響 :以料液比為 1. 0 17. 5, 加入 40%乙醇 , 60 提取 1次 。 提取時間對提取效果的影響見表 3。 隨著提取時間的延長 , 提取率先是不斷地增加 , 而且幅度 較大 ; 當提取時間超過 45m in 后

16、, 提取率稍有下降 , 但幅度不 大 。 這說明提取時間為 45m in 時 , 蒲公英總黃酮的提取達到 平衡狀態(tài) , 繼續(xù)延長提取時間 , 也無法使更多的黃酮類物質溶 出 。 所以 , 浸提時間 45m in 較適宜 。表 3 提取時間對提取率的影響提取時間 /min 提取率 /%提取時間 /min 提取率 /% 156. 15606. 67 306. 62756. 67 457. 00 提取溫度對提取率的影響 :以料液比為 1. 0 17. 5, 加入 40%乙醇 , 不同溫度下提取 1次 , 時間為 45m in 。 提取溫度對 提取效果的影響見表 4。 提取率在溫度為 3050 過程中

17、變 化不大 , 但在 50 處開始增大 , 溫度達到 60 時 , 提取率達到最大值 。 這說明黃酮類化合物隨著溫度的升高其溶解度也越來越大 , 浸提效果也越來越好 。 但是溫度過高 , 雜質的溶出 量也越多 , 而且對黃酮類化合物的穩(wěn)定性不利 , 容易使其發(fā)生 氧化變質 , 失去應有的性質 。 所以 , 提取溫度選擇 60 。 表 4 提取溫度對提取率的影響提取溫度 / 提取率 /%提取溫度 / 提取率 /% 305. 370607. 317 405. 270706. 270 505. 487806. 780 提取次數對提取率的影響 :以料液比為 1. 0 17. 5加入 40%乙醇 , 6

18、0 提取 , 每次提取時間為 45m in, 提取次數對提 取效果的影響見表 5。隨著提取次數的增加 , 提取率也不斷 增加 , 效果也越來越好 ; 當提取次數為 4次時蒲公英總黃酮提 取率基本達到最大值 , 殘渣中的黃酮類化合物已基本提盡 , 效 果最好 ; 再繼續(xù)增加提取次數 , 提取率變化很小 , 已沒有意義 。 由此 , 為了保證總黃酮的提取率和節(jié)省時間 , 本試驗選擇最佳 提取次數為 4次 。表 5 提取次數對提取率的影響提取次數 /次 提取率 /%提取次數 /次 提取率 /% 16. 84416. 95 27. 93517. 00 39. 67 提取條件優(yōu)化試驗設計 :根據單因子試

19、驗結果 , 選出料液 比 、 提取時間 、 提取溫度和提取次數等因素進行 L9(34 正交 試驗 , 結果見表 6。 由表 6的結果可知 , 在正交試驗設計的范圍內 , 最佳的實驗方案為 A3B 1C 3D 2, 即料液比 1. 0 20. 0, 浸提 溫度 70 , 提取次數 4次 , 每次提取時間 30m in 。 7號試驗的 條件與最佳方案相同 , 其所對應的提取率也是最高的 , 說明正 交試驗的結果是正確的 。表 6(A / mL (B溫度(C /次數(D /次提取 率 /% 11. 0305039. 40 04560411. 26 31. 0 15. 06070516. 09 41.

20、 0 17. 53060511. 50 51. 0 17. 54570310. 39 61. 0 17. 5605049. 83 71. 0 20. 03070417. 51 81. 0 20. 0455059. 81 91. 0 20. 0606039. 95 k 112. 2412. 809. 669. 91k 210. 5810. 4710. 9012. 86k 312. 4211. 9614. 6612. 46極差 1. 842. 335. 002. 96最佳條件 A 3B 1C 3D 2 精密度試驗 :取蒲公英粉末 4份 (每份 0. 5g , 按正交試 驗所確定的最佳條件 , 加

21、40%乙醇溶液進行提取 , 過濾收集 濾液 ; 取濾液 1mL, 加水稀釋至 5mL, 再取 1mL 稀釋液進行 顯色 , 于 510n m 處平行測定吸光度 , 并計算提取率 , 結果見表 7。 經計算 , 試驗的相對標準偏差為 0. 41%, 說明試驗精密度 高 , 重復性非常好 。表 7 精密度試驗結果試驗號 蒲公英粉 /g吸光度 A 提取率 % 10. 50020. 203018. 8 20. 50010. 201018. 7 30. 49970. 201518. 7 40. 50010. 202518. 8 3 抑菌試驗結果蒲公英粗總黃酮對黑曲霉、 宛氏擬青霉、 釀酒酵母和枯草 桿菌

22、的抑菌效果見表 8。 分別觀察培養(yǎng) 24、 36、 50h 時的菌種 生長情況 , 結果表明 , 蒲公英總黃酮對霉菌中的宛式擬青霉和 革蘭氏陽性菌的典型菌種枯草桿菌具有良好的抑菌作用 , 24、 36h 幾乎沒有菌體生長 , 50h 產生的菌體較少 ; 對真菌中的釀 酒酵母具有一定的抑菌作用 , 24h 時沒有菌體生長 , 36h 有少 量菌體生長 , 而 50h 產生的菌體較多 ; 對黑曲霉沒有抑菌作用。 表 8 蒲公英總黃酮的抑菌效果時間 /h黑曲霉空白 粗總黃酮宛氏擬青霉空白 粗總黃酮釀酒酵母空白 粗總黃酮枯草桿菌 空白 粗總黃酮 24+-+-+-36+-+-50+ 注 :-無菌生長 ;

23、 +菌體較少 ; +菌體較多 ; +菌體很多。44 東 北 林 業(yè) 大 學 學 報 第 35卷4 結論研究了從蒲公英中提取總黃酮的提取條件 , 通過對提取影 響因素的試驗研究 , 得出優(yōu)化的提取條件為 :以 40%乙醇為提 取劑 , 在 70 、 料液比 1 20條件下提取 4次 , 每次提取時間 30m in, 蒲公英粗總黃酮的提取率為 17. 51%(以蘆丁計 。最佳提取條件下 , 試驗的相對標準偏差為 0. 41%, 說明 試驗重復性非常好 。分析了蒲公英粗總黃酮對黑曲霉 、 宛氏擬青霉 、 釀酒酵母 和枯草桿菌的抑菌效果 。 結果表明 , 0. 43g/L的蒲公英總黃 酮對霉菌中的宛式

24、擬青霉和革蘭氏陽性菌的典型菌種枯草桿 菌具有良好的抑菌作用 , 對真菌中的釀酒酵母具有一定的抑 菌作用 , 對黑曲霉沒有抑菌作用 ?？梢钥紤]提高粗總黃酮的 加入量來進一步研究其對黑曲霉的抑菌效果 , 并有必要研究 蒲公英粗總黃酮對不同菌種的最低抑菌質量濃度 , 從而為開 發(fā)一種天然的抑菌劑奠定良好的基礎 。參 考 文 獻1 淵小春 , 魏希穎 , 張榮奎 , 等 . 兩種培養(yǎng)基對蒲公英體外抑菌效果觀察 J.陜西師范大學學報 :自然科學版 , 2004, 32(2 :97-100. 2 呂俊華 , 邱世翠 , 張連同 , 等 . 蒲公英體外抑菌作用研究 J .時珍國醫(yī)國藥 , 2002, 13(

25、4 :215-216. 3 劉華 , 吳國榮 , 孫曉明 , 等 . 不同生境下的蒲公英及其不同器官的分段提取物抑菌作用比較研究 J .中國野生植物資源 , 2001, 20(3 :37-38. 4 代紅 , 李慧芬 , 王承務 . 蒲公英五種提取物的體外抑菌試驗 J .首都醫(yī)藥 , 1999, 6(8 :32-33. 5 王立娟 . 桔皮總黃酮的提取條件 J .東北林業(yè)大學學報 , 2006,34(5 :70-72.(上接 42頁 圖 12 三聚氰胺聚乙烯醇改性脲醛樹脂總反應結束時的 13C -NMR 譜圖3 結論研究了脲醛樹脂及其幾種改性樹脂不同反應階段的化學 位移 , 并給出了它們的結構

26、變化 , 詳細討論了改性劑存在條件 下化學位移的變化規(guī)律及結構上存在的差異 。分析表明脲醛樹脂和聚乙烯醇改性脲醛樹脂存在相同的 反應特征和結構特征 , 比較脲醛樹脂和聚乙烯醇改性脲醛樹 脂 , 未發(fā)現(xiàn)聚乙烯醇參加反應的結構特征 。 因此 , 在本研究范 圍內聚乙烯醇的改性作用不是化學上的 。三聚氰胺的改性作用在于 , 它不僅能與甲醛反應 , 而且能 與尿素甲醛發(fā)生共縮聚反應 , 使改性脲醛樹脂既表現(xiàn)出三聚 氰胺甲醛樹脂的特性 , 也表現(xiàn)出了不同于脲醛樹脂的特性 。結構分析表明 , 在縮聚階段除了有亞甲基化的反應外 , 還 存在著醚鍵的分解反應 。少量的醚鍵在反應結束后仍然存 在 , 這是人造板

27、在熱壓階段或使用過程中仍存在甲醛釋放的 原因之一 。通過對化學位移和化學結構的分析 , 說明通過分次加尿 工藝來降低脲醛樹脂中的游離甲醛含量是合理的 , 游離尿素 其實并不存在 , 尿素主要以一取代脲和二取代脲的形式存在 , 這是樹脂中游離甲醛含量降低的根本原因 。參 考 文 獻1 T o mita B, Hse Chung -Yun . Analysis of cocondensati on of mela mineand urea thr ough f or maldehyde with carbon 13nuclear magnetic res o 2nance s pectr osco

28、pyJ.Mokuzai Gakkaishi, 1995, 41(3 :349-354.2 Tom ita B, H se Chung -Yun . Study of co -condensati on of mela 2m ine and urea with carbon 13enriched f or maldehyde by carbon 13nuclear magnetic res onance s pectr oscopyJ .Mokuzai Gakkaishi, 1995, 41(5 :490-497. 3 No B Young, Ki m Moon G . Syntheses an

29、d p r operties of l ow -levelmelam ine -modified urea -mela m ine -for maldehyde resins J .Journal of App lied Poly mer Science, 2004, 93(6 :2559-2569. 4 Sii m er K, Kaljuvee T, Christjans on P, et al . Changes in curing be 2havi our of am inoresins during st orageJ .Journal of Ther mal Anal 2ysis a

30、nd Cal ori m etry, 2005, 80(1 :123-130.5 Mercer A T, Pizzi A. A 13C -NMR analysis method f or MF andMUF resins strength and for maldehyde e m issi on fr om wood particle 2board . II . MF resins J .Journal of App lied Poly mer Science, 1996, 61(10 :1697-1702. 6 Ki m Moon G . Exa m inati on of selected synthesis para meters for typ i 2cal wood adhesive -type urea