熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測乙型肝炎病毒DNA及其與血清標志物的關(guān)

1、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測乙型肝炎病毒DNA及其與血清標志物的關(guān)    【摘 要】 目的 用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)方法定量檢測血清中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的數(shù)量及探討其與HBV標志物(HBVnbsp;M)表現(xiàn)模式的關(guān)系，以指導(dǎo)臨床。方法 共244份臨床血清     福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院(350001)陳建森鄭華卓光生曾德成【摘要】目的用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fl

2、uorescencequantitativepolymerasechainreaction，F(xiàn)Q-PCR)方法定量檢測血清中乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）的數(shù)量及探討其與HBV標志物(HBV M)表現(xiàn)模式的關(guān)系，以指導(dǎo)臨床。方法共244份臨床血清標本，HBV DNA定量采用熒光定量PCR分析系統(tǒng)，HBV M采用ELISA法。結(jié)果經(jīng)FQ-PCR檢測，99例HBsAg（）HBeAg（）HBcAb（）的標本，其血清標本HBV DNA亦全部陽性，平均HBV DNA拷貝數(shù)為1.82×107copiesml；96例HBsAg（）HBeAb（）HBcAb（）的標本，其HBV

3、 DNA檢出率為66.7%(64例)，平均拷貝數(shù)為1.82×104copiesml；11例HBsAg（）HBcAb（）的標本其HBV DNA檢出率為63.6%(7例)，平均拷貝數(shù)為7.94×104copiesml。結(jié)論血清HBV DNA水平與HBV M表現(xiàn)模式有關(guān)，HBsAg（）HBeAg（）HBcAb（）的標本HBVDHA值顯著高于HBsAg（）HBeAb（）HBcAb（）的標本和HBsAg（）HBcAb（）的標本，提示HBsAg與HBeAg的存在影響HBVDNA水平。FQ-PCR能實現(xiàn)準確定量，可以檢測HBV的真實感染和復(fù)制情況，對于乙型肝炎的臨床診斷、治療方案的選擇和

4、療效考察有較大的指導(dǎo)意義?！娟P(guān)鍵詞】肝炎病毒，乙型；DNA，肝炎病毒，乙型；定量 PCR Compare the relationship between hepatitis B virus DNA detected byfluorescence quantitative PCR and hepatitis B virus markersChen Jian Sen,Zheng Hua Shen,Zeng De Cheng.Union Hospital,Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China 【Abstract】ObjectiveToexplo

5、retherelationshipbetweenhepatitisBvirusDNAandhepatitisBvirusmarkersMethods244clinicalserumsampleswerecollectedHepatitisBvirusDNAwasdetectedbyFQ-PCRandhepatitisBvirusmarkersweredetectedbyELISAResultsIn99HBsAg（）HBeAg（）HBcAb（）samples，F(xiàn)Q-PCRresultswerepositive，with1.82×107copiesmlofHBVDNA averageIn

6、96HBsAg（）HBeAb（）HBcAb（）samples，theaveragewas1.82×104copiesmlwithapositiverateof66.4In11HBsAg（）HBcAb（）samples，theaveragewas7.94×104copiesmlwithapositiverateof63.6ConclusionsThereisasignificantcorrelationbetweenHBVmarkersandHBVDNATheHBsAg（）HBeAg（）HBcAb（）samplesweresignificantlyhigherthantheH

7、BsAg（）HBeAb（）HBcAb（）samples andtheHBsAg（）HBcAb（）samplesFQ-PCRcanbeusedtomonitorthetruestateofHBVinfectionandamplification【Keywords】Hepatitisvirus，B；DNA，hepatitis virus,B；Quantitative PCR乙型肝炎病毒感染是影響我國人民健康最重要的傳染病之一，現(xiàn)我國約有1.2億人口為HBV攜帶者1，乙型肝炎病毒感染所致的慢性乙型肝炎病程遷延，有進一步發(fā)展為肝硬化或肝功能衰竭的可能，甚至于發(fā)展成肝癌，因此對HBV的檢測是較為關(guān)注的課

8、題。我們采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測了244份臨床血清標本，并同時采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunoasorbentassay，ELISA）進行對照檢測，報告如下。1材料與方法1.1材料1.1.1標本來源：244份臨床血清標本來自2001年11月2002年5月到我科作乙型肝炎血清標志檢測者標本，根據(jù)其HBV M表現(xiàn)模式分為9組。所有標本均為隨機抽樣。1.1.2儀器：德國羅氏公司LightCycler熒光定量PCR儀。1.1.3HBV DNA定量檢測試劑盒：深圳匹基生物工程技術(shù)股份有限公司出品。1.1.4HBV ELISA檢測試劑盒：廈門新創(chuàng)生物工程有限公司出品。1.

9、2方法1.2.1HBV DNA定量檢測：采用德國羅氏公司LightCycler熒光定量PCR儀及深圳匹基生物工程股份有限公司生產(chǎn)的HBV DNA熒光定量檢測試劑盒進行HBV DNA定量檢測，嚴格按照儀器及試劑盒說明書操作。1.2.2HBV M檢測：采用ELISA方法檢測，嚴格按照試劑盒說明書操作。1.2.3定量結(jié)果統(tǒng)計方法：定量結(jié)果采用求對數(shù)平均值的方法計算HBV DNA的平均拷貝數(shù)，遇有陰性結(jié)果，不參與平均值的統(tǒng)計。統(tǒng)計學(xué)方法采用配對t檢驗。2結(jié)果2.1FQ-PCR檢測HBV DNA定量結(jié)果：見表1。表1 各HBV M表現(xiàn)模式及FQ-PCR檢測其HBV DNA定量結(jié)果   

10、;  模式 HBV M表現(xiàn)模式 例數(shù) 陽性 數(shù) 陽性率 (%) 平均HBV DNA (copiesml) 平均HBV DNA對數(shù) （lgcopiesml)    HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb    1 + - + - + 99 99 100 1.82×107 7.26±1.24    2 + - - + + 96 64 66.7 1.82×104 4.26±1.51  

11、;  3 + - - - + 11 7 63.6 7.94×104 4.90±1.69    4 - + - - - 3 0 0     5 - - - - + 2 0 0     6 - + - - + 14 1 2.1 2.14×104 4.33    7 - + - + + 9 0 0    8 - - - + + 2 1 50 9.12&#

12、215;102 2.96    9 - - - - - 8 0 0     注：遇有陰性結(jié)果，不參與平均值的統(tǒng)計 2.2常見HBV M表現(xiàn)模式其HBV DNA檢測結(jié)果的比較，見表2。表2 HBV標志物不同模式HBV DNA檢測結(jié)果     模式 P值    與1組相比 與2組相比    1     2 P0.01    

13、0;3 P0.01 P0.05    3討論聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可對特定基因進行擴增，因此被廣泛應(yīng)用于獲取特定基因或基因片段及臨床基因診斷等領(lǐng)域。普通PCR應(yīng)用于基因診斷有許多局限性，主要一是不能準確定量，二是由于太靈敏，容易交叉污染，產(chǎn)生假陽性。為了克服上述不足，人們采取了許多方法，但均不很成功，直到最近熒光能量傳遞技術(shù)（fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）應(yīng)用于PCR定量后上述問題才得到較好的解決。FRET是指通過供受體發(fā)色團之間偶極-偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團轉(zhuǎn)移至受體發(fā)色團，轉(zhuǎn)移效率與兩個發(fā)色團

14、之間距離的6次冪成比例2。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)是檢測乙型肝炎病毒量，其檢測原理：采用LightCycler技術(shù)，它是Roche公司新近開發(fā)的一種PCR定量技術(shù)，該技術(shù)的特點是將熒光分子和淬滅分子分別標記在兩個不同的探針上，產(chǎn)生發(fā)光探針和淬滅探針，發(fā)光探針的5端連接熒光分子，淬滅探針的3端連接熒光分子。由于兩探針設(shè)計時可與模板同一鏈相鄰的序列雜交，雜交時兩探針的熒光分子和淬滅分子便緊密相鄰，從而發(fā)生FRET而使熒光淬滅。熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比，以此可以進行PCR定量分析。而作為臨床診斷HBV感染的傳統(tǒng)方法的ELISA，則實際上僅僅檢測的是人體對HBV的免疫反應(yīng)狀態(tài)。通過采用熒光定量聚

15、合酶鏈反應(yīng)檢測，我們可以發(fā)現(xiàn)1組與2組(P0.01)，及1組與3組(P0.01)，2組與3組(P0.05)相比有顯著性差異，從而可知HBV DNA的水平與HBeAg的存在有顯著的關(guān)系，與HBsAg的存在也有明顯的關(guān)系，說明HBeAg和HBsAg的存在一定程度上能反應(yīng)HBV的復(fù)制程度。5組HBcAb單一陽性的標本其HBV DNA定量檢測值雖然為陰性，但國內(nèi)外學(xué)者證明35，單純HBcAb陽性者中，在排除假陽性后，確存部分為HBV低水平復(fù)制，而因為本實驗所收集的相關(guān)標本少，可能影響結(jié)果的真實性。6組也檢測出HBV DNA，提示血中存在中等水平的HBV復(fù)制，說明未檢出HBsAg，有HBsAb、HBcA

16、b的出現(xiàn)并不能全部提示是既往HBV感染。8組中在HBeAb、HBcAb的存在下也可檢測出HBV DNA，可說明HBeAb的出現(xiàn)也不能表示HBV復(fù)制的停止。HBV M各種表現(xiàn)形式均可能存在不同程度的HBV復(fù)制，但因時間短，有些表現(xiàn)形式(如：單一HBsAg陽性和單一HBcAb陽性)標本收集得不夠多，從而可能導(dǎo)致有些表現(xiàn)模式的檢出率低。HBV DNA的定量檢測在抗病毒治療方法及療效評價等方面也具有很大的應(yīng)用價值。慢性乙型肝炎目前較好的治療藥物首推干擾素和拉米夫定，研究表明，血清中HBV的數(shù)量與干擾素的療效有一定相關(guān)性，治療前HBVDNA100pgml者中50%有效，而200pgml者中只有7%有效。HBV DNA定量檢測在決定是否繼續(xù)用拉米夫定治療上也十分有用，它對拉米夫定有應(yīng)答的病人在3個月的治療后保持HBV DNA陽性的幾率很低。臨床上一般認為HBV DNA105拷貝/ml為完全應(yīng)答；部分應(yīng)答為未達完全應(yīng)答標準但定量下降大于2個對數(shù)級；無應(yīng)答為未達上述標準。FQ-PCR能實現(xiàn)準確實時定量，可以檢測HBV的真實感染和復(fù)制情況，對于乙型肝炎的臨床診治、治療方案的選擇和療效考察有較大的指導(dǎo)意義。 參考文獻1.劉厚鈺慢性肝炎見，葉任高主編內(nèi)科學(xué)北京：人民衛(wèi)生出版社，2001，4534562.王小紅熒光定量PCR技術(shù)研究進展國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊，2001，23(1)：424