肉桂醛、檸檬醛抑制黃曲霉生長機(jī)制研究

1、肉桂醛、檸檬醛抑制黃曲霉生長機(jī)制研究                 【摘要】 目的 研究中藥活性成分肉桂醛、檸檬醛對黃曲霉細(xì)胞膜麥角固醇生物合成的影響，以探討其抗菌的作用機(jī)制。方法 將黃曲霉接種在含有不同濃度藥物的蔡氏固體培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)不加藥物為空白對照，置265恒溫培養(yǎng)3d，刮取平皿上菌苔，稱重、皂化，提取真菌中的難皂化脂，高效液相色譜(HPLC)法測定其中的麥角固醇含量。結(jié)果 檸檬醛濃度為016g/ml、肉桂醛濃度為009g/m

2、l作用黃曲霉后，麥角固醇含量較未用藥組顯著降低。結(jié)論 肉桂醛、檸檬醛可能通過影響黃曲霉麥角固醇的生物合成抑制黃曲霉生長。 【關(guān)鍵詞】 肉桂醛黃曲霉廣泛分布于自然界，極易引起物品霉變。食品等物品霉變除造成直接重大的經(jīng)濟(jì)損失外，某些產(chǎn)毒株產(chǎn)生的毒素，還可導(dǎo)致腫瘤高發(fā)，嚴(yán)重危害人和動物健康1。目前主要利用化學(xué)防腐劑抑制真菌的生長， 化學(xué)防腐劑種類繁多，廣泛應(yīng)用于食品方面的有山梨酸、苯甲酸、丙酸及其鹽類以及納它霉素等，但這些防腐劑防霉效果不是很理想，而且對人和動物多有潛在的毒性。中藥活性成分肉桂醛、檸檬醛作為食品防腐劑已應(yīng)用于食品工業(yè)，但對其抗菌機(jī)制研究較少。本研究室實(shí)驗(yàn)表明，中藥活性成分肉桂醛、檸檬

3、醛有良好的抗黃曲霉作用2-5。本文用高效液相色譜(HPLC)法測定了肉桂醛、檸檬醛作用黃曲霉后真菌細(xì)胞膜麥角固醇含量的變化，以期探討抗真菌的作用機(jī)制，旨在為開發(fā)新型的食品天然防腐劑提供理論依據(jù)。1 材料與方法11 實(shí)驗(yàn)菌株 黃曲霉菌為標(biāo)準(zhǔn)株(CCCCMID A2)中國醫(yī)學(xué)真菌中心(南京)。12儀器與試劑 yknm高效液相色譜儀(美國 Gilching公司)；真菌培養(yǎng)箱；紫外分光光度計(jì)等。肉桂醛(中國上海雙喜香料制劑廠)，比重10471051(批號：20020401，純度95)；檸檬醛(德國Berlinrang Vnitden Augen de Haut vermiden公司)批號：002489

4、 S20085632，純度98%。，比重08870889(批號：002489 S20085632，純度98)；酮康唑(純度：200mg/片，批號：030418108，西安楊森制藥有限公司)，臨用前將酮康唑研成細(xì)粉并溶于二甲基亞砜，使其濃度為40mg/ml；麥角甾醇(美國Sigma公司)，用環(huán)己烷配成10mg/ml，-20保存；乙腈為色譜純；皂化劑：新鮮配制的含15%NaOH的90%乙醇溶液；蔡氏培養(yǎng)液6；其他試劑均為分析純。13 方法131 菌液制備 將試驗(yàn)菌株接種于蔡氏斜面，26培養(yǎng)至快速生長早期，活化2次，此時(shí)菌苔覆蓋斜面，加入蔡氏液體，吸管吹打菌苔使孢子游離于培養(yǎng)液中，用500目無菌尼龍

5、網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)及紫外分光光度計(jì)測定，調(diào)整孢子濃度為106個(gè)/ml。132 不同濃度藥液的制備 參照文獻(xiàn)2，5，于無菌、直徑為15cm的平皿內(nèi)分別加入檸檬醛916，611l，肉桂醛6364，4364l，酮康唑4l，將冷卻至50左右的蔡氏固體培養(yǎng)基50ml迅速倒入上述平皿內(nèi)，混勻(藥物終濃度分別為：檸檬醛，016，008g/ml；肉桂醛，013，009g/ml；酮康唑，32g/ml)，待其凝固。133 高效液相色譜HPLC法測定肉桂醛、檸檬醛對黃曲霉細(xì)胞膜麥角甾醇含量的影響 (1)樣品制備：將131制備的菌液接種在含有不同濃度藥物的蔡氏固體培養(yǎng)基中(孢子終濃度為104個(gè)/ml)，同

6、時(shí)設(shè)不加藥物為空白對照，置265恒溫培養(yǎng)3d，刮取平皿上的菌苔，稱菌濕重。各精密稱取濕菌約05g，加磷酸鹽緩沖液(PBS)25ml和皂化劑6ml，混勻，80水浴皂化60min。加石油醚(沸程3060)6ml提取3次，合并提取液，加水6ml洗滌2次，醚層于60水浴揮干，得未皂化脂7，加環(huán)己烷溶解使溶液體積為1ml/g濕菌，-20保存。(2)高效液相色譜條件：色譜柱：C8柱；流動相：已腈-水(955)；流速，10ml/min；檢測波長283nm，采用外標(biāo)法按峰面積進(jìn)行定量。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取25mg麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，用環(huán)己烷溶解配成10mg/ml作標(biāo)準(zhǔn)貯備液。用標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別配制05，02

7、5，0125，00625，00325，001625mg/ml等6份標(biāo)準(zhǔn)液，在(2)中建立的色譜條件下進(jìn)樣20l，每個(gè)濃度進(jìn)樣2次，以峰面積的均值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸處理。(4)精密度測定：在本實(shí)驗(yàn)條件下，將025，0125，00625mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于日內(nèi)及日間進(jìn)樣，測定日內(nèi)及日間相對標(biāo)準(zhǔn)差。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2次。(5)樣品測定：將(1)中制備好的樣品用本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件分別進(jìn)樣20l，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次，測定樣品中麥角甾醇的含量(n=3)。14 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS110軟件進(jìn)行分析。2 結(jié)果21 標(biāo)準(zhǔn)品麥角甾醇的出峰時(shí)間 按本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果

8、顯示，麥角甾醇的出峰時(shí)間在1617min。22 標(biāo)準(zhǔn)曲線 麥角甾醇含量在05001625mg/ml范圍內(nèi)的線性回歸方程為：y=4743636x+0507256(n=6,r=0999427)，麥角甾醇含量在此范圍內(nèi)與峰面積有很好的線性關(guān)系。23 麥角固醇的精密度測定 測定日內(nèi)及日間相對標(biāo)準(zhǔn)差，其RSD(相對標(biāo)準(zhǔn)差)分別在012%144%，10%202%。說明測定結(jié)筟肉桂醛、檸檬醛抑制黃曲霉生長機(jī)制研究(2) 歡迎您訪問范.文,之.家鬧叵中院茫?。24 肉桂醛、檸檬醛對黃曲霉細(xì)胞膜麥角甾醇含量的影響 以酮康唑?yàn)殛栃詫φ?，測定了肉桂醛、檸檬醛作用黃曲霉后麥角甾醇含量的變化。檸檬醛較高濃度016g/m

9、l、肉桂醛009g/ml作用黃曲霉后，麥角固醇含量較相應(yīng)未用藥組減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P001)，見表2。表1 麥角固醇的精密度測定（略）表2 用藥前后黃曲霉麥角固醇含量比較（略）注：與相應(yīng)對照組比較，*P005，*P0013 討論肉桂醛、檸檬醛是肉桂、山蒼子油的主要成分，且兩者已分別用于化工、食品、糧食防腐、醫(yī)療衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)表明，兩者有良好的廣譜抗真菌作用特別是有高效的抗曲霉作用。張文娟8、羅曼9等研究了檸檬醛致黃曲霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)和某些宏觀影響。麥角甾醇是真菌細(xì)胞質(zhì)膜的重要組成成分，它是一種準(zhǔn)平面體分子，通過與磷脂結(jié)合穩(wěn)定磷脂相，從而增加膜的穩(wěn)定性。麥角甾醇的缺乏，必將引起真菌細(xì)胞膜功能異常，

10、甚至發(fā)生細(xì)胞破裂。目前用于檢測細(xì)胞膜中麥角甾醇含量的方法有薄層層析法、高效液相色譜法等10。反向高效液相色譜分析法具有分析速度快、分離效能高、自動化程度好的特點(diǎn)而被廣泛使用。本實(shí)驗(yàn)以酮康唑?yàn)殛栃詫φ?，用反相液相色譜法測定了中藥活性成分肉桂醛、檸檬醛作用黃曲霉后細(xì)胞膜麥角甾醇含量的變化。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一定濃度的藥物作用后黃曲霉細(xì)胞膜麥角甾醇含量較陰性對照組減少，隨著藥物濃度的增加，麥角甾醇的含量也隨之減少。表明藥物影響了細(xì)胞膜麥角甾醇的生物合成，從而抑制了黃曲霉的生長繁殖。至于藥物抑制了麥角甾醇生物合成的哪一個(gè)環(huán)節(jié)或多個(gè)環(huán)節(jié)，還有待進(jìn)一步研究。通過測定真菌中麥角固醇含量，有助于探討抗真菌藥物的作用

11、機(jī)制，并為中藥活性成分的體外抗真菌作用研究提供方法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 潘崴，龐廣昌，張昀.黃曲霉毒素與食品安全J.食品研究與開發(fā)，2004，25(6)：11-13.2 謝小梅，許楊，付穎媛.微量液基稀釋法測定中藥活性成分的體外抗曲霉菌活性J.微生物學(xué)通報(bào)，2003，30(6)：89-93.3 謝小梅，許楊，方建茹.肉桂醛、檸檬醛對煙曲霉、黃曲霉細(xì)胞DNA、RNA的影響J.中草藥，2005，36(4)：558-560.4 謝小梅，張文平，付穎媛，等.肉桂醛、檸檬醛抗曲霉菌作用機(jī)制的研究J.中草藥，2004，35(4):430-432.5 謝小梅，方建茹，許楊.肉桂醛、檸檬醛抗黃曲霉作用的研究J.食品科學(xué)，2004,25( 9)：32-34.6 陳世平.真菌感染學(xué)M.沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出 （肉桂醛、檸檬醛抑制黃曲霉生長機(jī)制研究(3) 版社，2000：538-539.7 劉洪濤，高平揮，曹永兵.等.氣-質(zhì)聯(lián)用研究氟康唑?qū)Π啄钪榫薮忌锖铣傻囊种谱饔肑.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2002，16(5)：368-371.8 張文娟.內(nèi)桂醛抗黃曲霉作用及超微結(jié)構(gòu)觀察的研究J.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，27(5)：374.9 羅曼，蔣立科，吳子健.檸檬醛對黃曲霉質(zhì)膜損傷機(jī)制的初步研究J.微生物學(xué)報(bào)，2001，41(6)：723-730