菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究_圖文

1、廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究姓名：龍海榮申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：制糖工程指導(dǎo)教師：楊洋20090603菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究摘要黃酮類化合物是具有生物抗氧化性、抗衰老，治療心血管疾病、降低膽固醇水平等多種保健功能的生物活性物質(zhì)。菱角資源豐富，含有大量的生物活性物質(zhì)，本文以四角野菱殼為原料，主要研究了菱角殼黃酮的提取工藝，純化工藝，以及對得到的菱角殼黃酮產(chǎn)品進行初步鑒定，同時研究了菱角殼黃酮的抗氧化活性。主要實驗結(jié)果如下：菱角殼黃酮提取工藝的優(yōu)化。應(yīng)用超聲波輔助提取技術(shù)提取菱角殼黃酮具有省時、節(jié)能、高效等優(yōu)點，應(yīng)用價值較高。根據(jù)正交實驗得出其最優(yōu)提取

2、工藝條件為：甲醇濃度、提取時間分鐘、料液比：、超聲功率，在該條件下菱角殼黃酮的提取得率最高，為。菱角殼黃酮的純化工藝研究。以聚酰胺粉純化菱角殼黃酮效果最好，吸附量為干樹脂，吸附率為，解吸率為，最佳吸附時間為小時。以上樣液濃度，流速，分別用、的乙醇洗脫可有效分離菱角殼黃酮，分別得到樣品、，總黃酮含量分別為、。經(jīng)紫外光譜、高效液相色譜及紅外光譜鑒定得出：樣品為結(jié)構(gòu)較簡單的酚類化合物，樣品、為沒食子酸類化合物，樣品為黃酮。菱角殼提取物的抗氧化活性研究?？寡趸瘜嶒烇@示菱角殼提取物是優(yōu)良的抗氧化劑：菱角殼提取物的還原能力和清除自由基能力和相當(dāng)，大于合成抗氧化劑，清除能力和提取物的總黃酮含量相關(guān)，總黃酮含

3、量越高則清除能力越強。在清除羥自由基實驗中，菱角殼提取物的清除能力遠大于和；而清除超氧陰離子自由基實驗的結(jié)果顯示提取物的清除率都超過，菱角殼提取物的清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力與提取物中的總酚含量相關(guān)，總酚含量越高則清除率越高。關(guān)鍵詞：菱角殼黃酮提取工藝分離抗氧化，：，：，：，（），一，：仔；廣西大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明和使用授權(quán)說明原創(chuàng)性聲明本人聲明：所呈交的學(xué)位論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的，研究工作所取得的成果和相關(guān)知識產(chǎn)權(quán)屬廣西大學(xué)所有，本人保證不以其它單位為第一署名單位發(fā)表或使用本論文的研究內(nèi)容。除已注明部分外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表過的研究成果，也不包含本人為獲得其它學(xué)位而使用

4、過的內(nèi)容。對本文的研究工作提供過重要幫助的個人和集體，均已在論文中明確說明并致謝。：花撕曲夕年學(xué)位論文使用授權(quán)說明照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本：務(wù)：多月節(jié)本人完全了解廣西大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：按學(xué)校有權(quán)保存學(xué)位論文的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服學(xué)校可以采用影印、縮印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存論文；在不以贏利為目的的前提下，學(xué)校可以公布論文的部分或全部內(nèi)容。請選擇發(fā)布時間：妲靠口時發(fā)布口解密后發(fā)布（保密論文需注明，并在解密后遵守此規(guī)定）論文作者簽名：商像翩簽名：否月多嚴日廣西大掌碩士學(xué)位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究第一章緒論幾千年來，人類

5、主要依靠植物得以生存，無論是植物食物還是植物藥，都為人類的繁衍生息作出了巨大的貢獻，食物鏈中不可能沒有植物的參與，目前臨床上使用的藥物中仍有直接或間接來源于植物【。植物是開發(fā)新藥和保健食品的最重要原料，對植物活性成分的研究是植物藥和保健食品領(lǐng)域的研究熱點。菱角概述及研究現(xiàn)狀菱角簡介菱角是菱科植物的果實，中藥大辭典所收錄名為菱；在別錄中收錄名為菱、菱實、菱角。全國中草藥匯編、長白山植物志、中國高級植物圖鑒等文獻中，均收錄此植物。形態(tài)菱角【】，為菱科（）菱屬（）一年生水生草本。葉二型，浮生葉聚生于莖頂部，成蓮座狀；葉柄中部膨脹成海綿質(zhì)氣囊，被柔毛；葉片三角形，邊緣上半部有粗鋸齒，近基部全緣上面綠色

6、無毛，下面脈上有毛。沉浸葉羽狀細裂。花兩性，白色，單生于葉腋；花萼深裂；花瓣；雄蕊；子房半下位，室，花柱鉆狀，柱頭頭狀花盤雞冠狀。堅果倒三角形，兩端有刺?；ㄆ谠?；果期月。分布卅菱角原產(chǎn)亞洲和歐洲的溫暖地區(qū)，只有印度和中國進行了馴化和栽培利用。我國的浙江省多年前就已經(jīng)有菱角栽培，它主要生長在湖泊淺水或池沼之中，適宜氣候溫暖的環(huán)境，不耐霜凍，但可在深水中生長，對生長的水域環(huán)境要求不嚴格。目前我國的菱角種植面積約公頃，年產(chǎn)量大約萬噸，主要分布在湖網(wǎng)密集地區(qū)，如山廣西大掌碩士學(xué)位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究東、江蘇、湖南、湖北、浙江、廣西、廣東、云南和臺灣省南部地區(qū)，朝鮮、日本、俄羅斯遠

7、東地區(qū)也有分布。營養(yǎng)成分菱角的果肉為白色，味道甘甜，細膩，營養(yǎng)豐富，是我國重要的可食果資源。菱角的營養(yǎng)豐富，其主要的營養(yǎng)成分為：水分，脂肪，蛋白質(zhì)，膳食纖維，碳水化合物，熱能，同時菱角中還含有鈣、磷、鐵、胡蘿素、硫胺素、核黃素、尼克酸和豐富的、。菱角中還含有種氨基酸，其中精氨酸、谷氨酸含量特別高，果肉中除苯丙氨酸、異亮氨酸外，其余的氨基酸含量普遍高于絞股藍地下莖中氨基酸含量。菱角的果肉中含有種人體必需氨基酸，總含量為，遠高于野山參的及西洋參的。由此看來菱角的營養(yǎng)成分含量豐富，種類齊全，比例協(xié)調(diào)，具有較高的營養(yǎng)保健和開發(fā)利用價值。食用和藥用價值菱角食用和藥用價值較高。齊民要術(shù)載，“菱芝中米，上品

8、藥，食之安神補臟，養(yǎng)神強志，除百病，益精氣，耳目聰明，輕身耐勞。蒸糧蜜和食之，長生似神仙。中藥大詞典載】，“菱肉可治一切腰腿筋骨疼痛，周身四肢不仁，風(fēng)濕入殼之癥”；菱葉可“擦小兒走馬疳”和“小兒頭癥；菱殼可治腹瀉、脫肛、痔瘡、黃水癥、天皰瘡；菱莖可治胃潰瘍及多發(fā)性疣贅；菱粉可補脾胃，強腰膝、健力益氣、行水、去署、解毒。由于菱角食療存在保健功效，醫(yī)學(xué)家用它制成許多食療滋補品，如鮮菱汁飲料、菱蜜茶、菱粉粥等。另據(jù)本草綱目載，菱另錄水棗，風(fēng)俗通沙角，用來安中補五臟，解丹毒；鮮者，解傷寒積熱，止消渴，解酒毒、射罔毒；侯士良主編中藥八百種詳解載【】，菱性味：甘、淡、平；古今用來：清暑解熱，用于夏季中暑、

9、煩躁口渴、傷寒積熱、瘧疾；除濕祛風(fēng)，用于風(fēng)濕痹痛、腰腿疼痛、周身四肢麻木不仁，全身泛發(fā)性濕疹、風(fēng)疹等；益氣健脾，用于脾胃虛弱、脘腹脹滿、消化不良、聲音低弱，甚至脫肛等；解酒毒，用于酒后煩渴；抗癌，用于食道癌、乳腺癌、宮頸癌等。菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究菱角國內(nèi)外研究情況國外研究情況日本的系川秀治等人對種植物進行了抗腫瘤活性篩選，試樣以蒸餾水、乙醇加熱提取，用腹水腫瘤作總細胞容積法依據(jù)，實驗結(jié)果表明，菱角的水提物抑瘤率為；菱角的醇提取物抑瘤率為。日本中田壽信等人從菱角中分離出谷甾醇，小官卓夫等人從菱角的果實中提取出沒食子酸來代表其水浸膏的活性成分【】。在北美，菱角是外來入侵物種，生物

10、學(xué)家們主要進行的研究是如何防止它的入侵以及對水體的影響，而有關(guān)菱角的化學(xué)成分和活性物質(zhì)方面的研究報道很少。國內(nèi)研究情況近幾年來，國內(nèi)學(xué)者在前人的研究基礎(chǔ)上，對菱角這種植物進行了更加系統(tǒng)與深入的研究。我國學(xué)者郭峻等【】做了帶蒂菱殼水提物對大腸桿菌回復(fù)突變的抑制作用研究，結(jié)果說明該水提物使所致的相對突變活性下降到以下。張延嶺等【】用山東平湖菱肉進行小鼠抑瘤實驗及肝癌抑瘤實驗，結(jié)果顯示：對小鼠肉瘤的抑制率為，對小鼠肝癌的抑瘤率為。除菱角的抗癌活性外，學(xué)者們也對菱角淀粉進行了比較深入的研究。臺灣研究了菱角在生長過程中淀粉的性質(zhì)變化【】，得出菱角在成熟期前淀粉含量由上升到。湖南農(nóng)大的李向紅等】也對菱角淀

11、粉的理化性質(zhì)進行了研究，得出菱角淀粉支鏈淀粉含量為。在菱角的生物活性物質(zhì)方面，牛鳳蘭等人的研究小組【?！康葘|北菱進行了較為系統(tǒng)的研究，對東北菱的質(zhì)量標準，營養(yǎng)成分，抗腫瘤成分等進行了研究，得出沒食子酸可能為東北菱的抗腫瘤成分，也對黃酮類化合物的初步研究，初步確定菱角中含有黃酮類化合物。尚慶坤等【，】對菱角中的生物堿和多糖類物質(zhì)進行了研究，對菱角殼的生物堿進行分析得出水溶性生物堿占；對菱角殼中的多糖和單糖組成進行了確定。廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究黃酮類化合物概述】黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，屬植物次生代謝產(chǎn)物，泛指兩個具有羥基的苯環(huán)（和）通過中央三個碳

12、原子相互連結(jié)而成的具有骨架結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)的一系列化合物及衍生物。其母核為一苯基苯并吡喃酮（圖）。一一苯基苯并吡喃酮圖黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)根據(jù)中央三碳鏈的氧化程度，環(huán)（苯基）連接位置（位或位）以及碳鏈是否成環(huán)狀等特點，可將黃酮類化合物分成黃酮類、黃酮醇類、雙氫黃酮類、雙氫黃酮醇類、異黃酮類、雙氫異黃酮類、查爾酮類、雙氫查爾酮類等幾大類。黃酮類化合物的理化性質(zhì)】理化特性黃酮類化合物大多為結(jié)晶性固體，少數(shù)的黃酮苷類為無定形粉末。游離的苷元母核中，除二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃烷和黃烷醇有旋光活性以外，其余的都沒有光學(xué)活性。黃酮苷類由于在結(jié)構(gòu)中引入糖的分子，所以都有旋光性，且大多為左旋。黃酮類化合物是否有顏

13、色與分子中是否存在交叉共扼體系，助色團（，等）的種類、數(shù)目以及取代位置有關(guān)系。一般情況下，黃酮、黃酮醇及其苷類顯灰黃色或黃色，查爾酮為黃色或橙色，而二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類，因不具有交叉共扼體系或共軛鏈較短，一般沒有顏色或顯微黃色。菱角殼黃酮的提取、分離及執(zhí)氧化活性研究溶解性黃酮類化合物的溶解度與其結(jié)構(gòu)及存在的狀態(tài)相關(guān)。一般游離苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑及稀堿水溶液中。其中黃酮、黃酮醇、查爾酮等平面性較強的分子，因分子與分子間的排列緊密，分子間引力較大，故難溶于水；而二氫黃酮及二氫黃酮醇等為非平面性分子，因而分子與分子間不緊密，分子間引力小，有利于水分

14、子的進入，因而溶解度稍大。黃酮類苷元分子中引入羥基，將增加在水中的溶解度；而羥基經(jīng)甲基化后會增加在有機溶劑中的溶解度。黃酮類化合物的羥基糖苷化后，在水中的溶解度會加大，而在有機溶劑中的溶解度則會相應(yīng)減小。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等強極性的溶劑，但難溶于苯、氯仿等弱極性溶劑。黃酮苷結(jié)合的的糖鏈越長，其溶解度則越大，另外，糖苷基的結(jié)合位置不同，對溶解度也有一定的影響。酸堿性黃酮類化合物因分子中多具有酚羥基，因而顯酸性，可溶于堿性水溶液、吡啶甲酰酸性強弱順序為：，二或一般酚吡喃環(huán)上的氧原子，因為有未共用的電子對，故表現(xiàn)微弱的堿性，可與強的無機酸，如濃硫酸、鹽酸等生成鹽，但生成的鹽極不穩(wěn)定，遇水

15、即可分解。黃酮類化合物的提取與純化方法提取方法（）熱水提取法加熱水提法可用浸提法也可用煮提法，一般提取到次，由于黃酮苷類物質(zhì)易溶山楂進行回流提取，得到質(zhì)量分數(shù)為的黃酮類物質(zhì)。采用水提法工藝優(yōu)點明胺以及二甲基甲酰胺中。由于酚羥基的取代位置不同，酸性強弱也不同。一般情況下的于水，因而該法常用來提取黃酮苷類含量較高的原料。蘇剛等用。（熱水浸泡顯，成本低，工藝安全，適合工業(yè)化生產(chǎn)，但同時容易把糖類、無機鹽、氨基酸等溶于水的成分提取出來【。（）堿性水或堿性稀醇提取法黃酮苷類物質(zhì)有一定極性，溶于水，一般易溶于堿性水，難溶于酸性水，故可先用堿性水進行提取，再將堿性提取液調(diào)成酸性，黃酮苷類物質(zhì)即可沉淀析出。堿

16、性提取時，所用堿的濃度不能過高，以免在強堿條件下加熱會破壞黃酮類化合物的母核結(jié)構(gòu)，加酸酸化時，酸性也不宜過強，否則易生成佯鹽，致使析出的黃酮化合物又重新溶解，降低產(chǎn)品收率。一般可以根據(jù)原料不同而使用不同的堿性溶液，例如從菊花中提取黃酮類物質(zhì)時，用為的溶液浸出效果較好【】。（）有機溶劑萃取法將干燥粉碎后的原料用其他方法進行粗提取后，用適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑（如乙酸乙酯、石油醚、正丁醇等）進行萃取、過濾，濾液中的溶劑減壓蒸餾回收，然后得到產(chǎn)品。這是目前國內(nèi)外使用較廣泛的提取方法，該法投資少，設(shè)備簡單，產(chǎn)品的得率高，但同時產(chǎn)品中的雜質(zhì)含量也較高。乙醇和甲醇是提取黃酮類化合物的最常用溶劑，高濃度的醇一般適合提

17、取苷元，左右的醇適合提取苷類。胡福良等【】提取蜂膠液中黃酮類化合物，得出的結(jié)論為乙醇提取的總黃酮含量最高。（）酶解法酶解法是指在黃酮提取過程中，通過加入適當(dāng)?shù)拿赴l(fā)生酶解反應(yīng)而使產(chǎn)品類黃酮得率和含量大大提高，對于一些黃酮類物質(zhì)被細胞壁包圍不易提取的原料可以采用該法。孟志芬等【用酶法提取香椿葉中的黃酮，其提取率較高，并且能避免大量有機溶劑的使用。（）超濾法當(dāng)溶液中含有兩種或兩種以上溶質(zhì)時，通過濾膜分離流動時，其中分子體積小的溶質(zhì)，可以經(jīng)濾膜流出，而分子體積較大的溶質(zhì)，因不能通過濾膜而被截留，這就是超濾法的工作原理。黃酮類化合物的分子量多在以下，而多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分子量多在以上，因而可使用超濾法

18、除去這些雜質(zhì)，提高藥液澄清度和有效成分含量，而且在分離過程中無相變，有效成分理化性能穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性好，準確性高。張效林等【用超濾法法提取側(cè)柏葉總黃酮時，有效地分開了鞣質(zhì)和脂溶性葉綠素等雜質(zhì)成分，結(jié)果令人滿意。（）超聲波輔助提取法超聲波法是利用超聲波的空化作用來破壞植物的細胞結(jié)構(gòu)，使溶劑易于滲入細胞內(nèi)部。同時超聲波的強烈振動能給植物原料和溶劑傳遞巨大的能量，使它們做高速的運動，加速細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放和溶解以及有效成分的浸出，大大提高了提取效率。陽文斌掣】采用超聲波法提取花生殼中總黃酮，其純度和產(chǎn)率均較高。劉海鵬掣”】用超聲波提取銀杏葉總黃酮比回流法提取率高，總黃酮提取率達?；舻と旱取尽吭诰C合考慮

19、工藝成本和工藝可行性條件下，采用超聲提取法提取山楂黃酮，提取時間大大縮短，產(chǎn)率較高，并且實驗可在室溫下進行，設(shè)備簡單，操作方便。（）微波輔助提取法本法多用在藥材的浸出上，它的原理是利用磁控管所產(chǎn)生的每秒數(shù)億次超高頻率的快速振動，使藥材內(nèi)分子間相互碰撞擠壓，促使藥材有效成分的快速浸出。在有效成分浸出過程中，藥材的原料細粉不糊化也不易產(chǎn)生凝聚，克服了熱水提取時易凝聚糊化的不足【】。等證實了微波法的方便快速性。吳雪輝等【】采用微波萃取技術(shù)提取板栗花提取率很高。劉峙嶸等【】采用微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物，與傳統(tǒng)的乙醇水溶液法提取效果進行對照，傳統(tǒng)的抽提時間為，而微波輻射后，只需要抽提就可達到效果。

20、利用微波處理的提取率是用傳統(tǒng)方法提取率的倍，微波法萃取黃酮類化合物省時、提取率高，是一種有發(fā)展前景的新工藝。（）超臨界流體提取法超臨界流體提取法（，）是以超臨界流體（，）為萃取劑，其中最為常用。在高壓超臨界狀態(tài)下，以液態(tài)作抽提溶劑進行抽提，然后減壓分離，隨著壓力下降，液態(tài)不斷氣化，從而分離出所需要的提取物【。方法具有提取效率高、無溶劑殘留、天然植物中活性成分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解破壞等優(yōu)點，同時還可以通過控制臨界溫度和壓力的變化達到選擇性提取和分離化合物的目的【。廣西大學(xué)碩士掌位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究黃酮類化合物的純化方法【，】黃酮類化合物的分離純化方法很多，有柱層析、薄

21、層層析、鉛鹽沉淀、硼酸絡(luò)合、梯度洗脫以及近年來應(yīng)用的高效液相制各色譜和高速逆流色譜（）等，但這些都因存在不同程度的缺點而限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。由于黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，其分離純化的方法也不同：極性大小不同，可利用吸附能力或分配原理進行分離；酸性強弱不同，可利用梯度萃取法進行分離；分子大小不同，可利用葡聚糖凝膠的分子篩作用進行分離；分子中某些特殊結(jié)構(gòu)，則可利用與金屬鹽絡(luò)合能力的不同進行分離。柱層析是最常用的分離方法，因為其使用較簡易，而受到廣泛的應(yīng)用。常用的柱層析填充物有：（）硅膠非極性和極性化合物都能用，應(yīng)用最廣適于分離黃酮類、黃酮醇類、雙氫黃酮類、雙氫黃酮醇類、異黃酮類和黃酮苷元類。在

22、利用硅膠柱色譜對黃酮類化合物進行純化時，選擇合適的洗脫劑是關(guān)鍵，各種洗脫劑的洗脫能力如下：石油醚四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯吡啶丙酮正丙醇乙醇甲醇水。（）活性炭活性炭來源容易，價格便宜，在水中吸附力大，在有機溶劑中吸附力小，對大分子化合物的吸附力大于對小分子化合物的吸附力?；钚蕴课椒ㄖ饕糜谲疹惖募兓?。（）離子交換樹脂離子交換法對黃酮類化合物的提取、分離、純化可一步完成，可除去黃酮類化合物中的水溶性雜質(zhì)。先用陰（或陽）離子交換樹脂吸附黃酮，然后用水洗滌柱子，把水溶性雜質(zhì)除去，再用醇溶液把黃酮類化合物依次洗脫下來。（）大孔吸附樹脂大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，是在離子

23、交換劑廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文菱角殼。黃。酮的提取、分離及抗氧，化活性研究和其它吸附劑應(yīng)用基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一類新型樹脂。吸附樹脂因為樹脂能夠?qū)ξ镔|(zhì)進行有選擇性地吸附因而能夠用于物質(zhì)的分離純化。這種吸附作用是吸附質(zhì)與吸附劑即吸附樹脂之間的作用力產(chǎn)生的。吸附樹脂對物質(zhì)的這種作用力可分為氫鍵力、定向力、誘導(dǎo)力和色散力。吸附樹脂的吸附特性主要取決于樹脂的化學(xué)性質(zhì)、比表面積和孔徑。按照樹脂的表面性質(zhì)分類，一般分為非極性、中極性和極性三類。非極性樹脂是由偶極矩很小的單體聚合制得的，不帶任何功能基的吸附樹脂，這類吸附樹脂孔表面的疏水性較強，可通過與小分子內(nèi)的疏水部分相互作用吸附溶液中的有機物，最適于由極性溶劑中

24、吸附非極性物質(zhì)。中極性吸附樹脂是含酯基的吸附樹脂，其表面疏水部分和親水性部分共存，因此，既可用于極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，又可用于由非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)。極性吸附樹脂是指含有酰胺基、氰基、酚羥基等極性功能基的吸附樹脂，該類樹脂最適用于由非極性體系里分離極性物質(zhì)。（）聚酰胺聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類大分子化合物。聚酰胺既有半化學(xué)吸附即氫鍵吸附色譜的性質(zhì)，又有分配色譜的性質(zhì)，屬于雙重色譜吸附劑。聚酰胺是分離黃酮類化合物理想的吸附劑，且其層析容量大，適用于制備性分離，可以將植物粗提物中的黃酮與非黃酮體、黃酮體苷元與苷分開。若采用含水溶劑系統(tǒng)（如：乙醇一水），非黃酮體水溶性成份及少數(shù)黃酮體苷可用

25、水沖洗下來。大多數(shù)黃酮體苷在，醇液中洗脫下來。黃酮體苷元的混合物用非極性溶劑系統(tǒng)分離較好。洗脫溶劑從高極性至低極性，以達到分離的目的。聚酰胺的層析原理主要是氫鍵吸附，聚酰胺的吸附作用是通過其酰胺羰基與黃酮化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合產(chǎn)生的，因此吸附作用的強弱取決于黃酮分子中酚羥基數(shù)目與位置以及洗脫溶劑的性質(zhì)。溶劑系統(tǒng)常用不同比例的乙醇水來分離苷和高度羥基化的黃酮。（）葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是具有許多孔隙的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固體，具有分子篩的性質(zhì)。分離游離黃酮時，主要依靠吸附作用，吸附強弱取決于含羥基的數(shù)目。分離黃酮苷時，則取決于分子篩屬性，洗脫時黃酮苷按分子量由大到小依次流出。廣西大掌碩士學(xué)位論文菱

26、角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究抗氧化劑抗氧化能力的評價方法隨著生物抗氧化劑和天然抗氧化劑研究的不斷深入，對抗氧化劑的抗氧化能力評價方法也在不斷的發(fā)展完善。目前，國內(nèi)外測定抗氧化劑抗氧化能力的方法可以說是多種多樣，但還缺乏一個科學(xué)完整的評價體系，主要包括體內(nèi)和體外評價兩大類?？寡趸瘎┑捏w內(nèi)測定評價方法主要有低密度脂蛋芻（）氧化分析法、動物試驗、生物體系中脂質(zhì)過氧化檢測法、人體血清中抗氧化能力與某種疾病相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查等，氧化分析法是從健康成人的血液中分離出，再利用過渡金屬離子（如）催化氧化修飾，加入抗氧化劑可抑制其氧化修飾的原理來評價受試物的抗氧化活性。脂質(zhì)過氧化檢測法，主要是用硫代巴比

27、妥酸法，通過測定血清或肝等組織勻漿中的脂質(zhì)過氧化物丙二醛（）的量來反映抗氧化劑抑制脂質(zhì)過氧化的能力【?？寡趸捏w外測定方法非常多，它是食品天然抗氧化劑篩選和研究的重要步驟，總的說來又可分為物理方法和化學(xué)方法。物理方法應(yīng)用較多的是電子順磁共振（，）法，這是檢測自由基最直接最有效的方法，它是根據(jù)自由基含有一個未成對電子，具有順磁性和很高的反應(yīng)活性，通過波譜儀來測定，此法優(yōu)點明顯，檢測迅速準確，但同時缺點也十分明顯，儀器設(shè)備較貴，不宜推廣?；瘜W(xué)方法主要有（油脂過氧化值）法和比色法等【，。法是利用抗氧化劑抑制油脂氧化的能力不同來比較抗氧化能力的強弱的試驗，通過測定油脂過氧化值的變化，來反映抗氧化劑的活

28、性。比色法主要是依據(jù)抗氧化劑對自由基具有捕獲能力或?qū)ρ趸瘎┚哂羞€原能力的原理，當(dāng)抗氧化劑或各種植物的提取液加入到人工合成的自由基或氧化劑中后，其在最大吸收波長處的吸光度將下降，而抗氧化能力與吸光度下降值之間呈線性相關(guān)關(guān)系后，可用分光光度計進行定性定量分析。對于不同的抗氧化劑，其抗氧化能力可根據(jù)清除原始自由基所用的抗氧化劑量（半效濃度，）的大小來比較，越小則抗氧化劑的抗氧化能力越耐。以下是幾種常見的抗氧化能力體外評價方法。清除自由基法清除（，二苯基一苦肼基自由基）法是近年來國內(nèi)外普遍使用的一種研究抗氧化劑的方法【】，它具有快速、簡便、靈敏、易檢測和直接可行的優(yōu)點【，被廣泛用于菱角殼黃酮的提取、分

29、離及抗氧化活性研究抗氧化劑的研究。自由基溶于有機溶劑【，是一種穩(wěn)定的質(zhì)子自由基。它的穩(wěn)定性主要來自共振穩(wěn)定作用及三個苯環(huán)的空間障礙，使夾在其中氮原子上的不成對電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對作用。自由基因為具有單電子而在紫外光譜中處有強吸收，呈深紫色，當(dāng)有自由基清除劑存在時，由于其單電子配對而使特征吸收逐漸消失，褪色程度與其接受的電子數(shù)呈定量關(guān)系。該自由基對光、強酸、強堿較為敏感，在強酸、強堿條件下能迅速失效，溶劑（水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿）的影響不大，因此試驗應(yīng)盡量在避光、酸堿性溫和的條件下進行。抗氧化能力越強，吸光度值下降越大，溶液的顏色越淡。清除羥自由基實驗利用和混合發(fā)生反應(yīng)，生

30、成具有很高反應(yīng)活性的，在體系內(nèi)加人水楊酸捕捉并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在下有最大吸收。但若加入具有清除作用的物質(zhì)，便會與水楊酸競爭，從而使有色產(chǎn)物生成量減少。因而可以利用吸光度值的變化來反映樣品清除羥自由基的能力【。清除超氧自由基實驗生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)中，大約有的氧會產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基的毒性是機體發(fā)生氧中毒的主要原因，表現(xiàn)在使核酸鏈斷裂、多糖解聚和不飽和脂肪酸過氧化作用，進而造成遺傳突變、酶系失活、膜損傷、線粒體氧化磷酸化作用改變等一系列變化。】。超氧陰離子自由基是生命活動代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的自由基，具有很強的氧化能力，因此在檢驗抗氧化物質(zhì)的活性時經(jīng)常把清除超氧陰離子自

31、由基作為其中一個重要的指標。產(chǎn)生超氧陰離子自由基的體系有多種，其中鄰苯三酚自氧化法所用試劑廉價，操作簡單快捷，是最為常用的方法。還原能力研究表明，抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在聯(lián)系【。還原能力是從提供電子能力的角度來檢測物質(zhì)的抗氧化性，抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子【。在反應(yīng)中，抗氧化劑提供的電子，能夠中斷自動氧化成氫過氧化物的鏈鎖反應(yīng)，這樣就可以廣西大學(xué)碩士掌位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究表現(xiàn)出該物質(zhì)的還原能力。測定還原能力實驗中常以作為氧化劑，將還原為，顏色由黃色變?yōu)樗{綠色，在紫外光譜中處有強吸收。吸光值越大，表明還原能力越強，抗氧化性越吲。測定抗氧化能力的方法有很

32、多種，由于測定過程受多種因素的影響，可能會造成測定結(jié)果不一致，因此對生物抗氧化劑抗氧化能力的評價應(yīng)從多個方面展開，進行綜合評價。選題依據(jù)大量的實驗研究表明黃酮類化合物具有抗氧化、抗過敏、抗菌消炎、降血糖、抗病毒、抗腫瘤和護胃保肝等功效。目前黃酮主要從銀杏葉、大豆、沙棘等植物中提取分離，文獻報道稱所有的植物中都含有黃酮類物質(zhì)【。菱角是我國傳統(tǒng)的水生經(jīng)濟作物，種植分布較廣，產(chǎn)量較大。有關(guān)菱殼中黃酮類化合物及其相關(guān)活性研究的文獻報道很少。本文采用廉價且來源較為豐富的菱角殼作為原料，提取其中的黃酮類物質(zhì)，探討菱殼黃酮存在形式和總含量，并研究其抗氧化性能，為綜合利用菱角資源提供一條有效途徑。研究內(nèi)容（）

33、利用超聲波醇提法對菱殼黃酮進行提取分離，并對提取工藝進行優(yōu)化。（）對菱殼中總黃酮的含量進行測定。（）利用柱色譜法采用幾種不同的樹脂對菱角殼黃酮進行純化研究，優(yōu)選出最適的樹脂和最佳的純化工藝。（）采用顏色反應(yīng)、紫外光譜、紅外光譜、和高效液相色譜法對菱角殼的純化物進行初步鑒定。（）采用不同的體外模型對菱角殼黃酮提取物進行抗氧化活性研究。菱，角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究第二章菱角殼黃酮的提取工藝研究材料、試劑與儀器實驗材料與試劑原料：菱角殼（四角野菱，產(chǎn)地：山東微山湖）試劑：乙醇、石油醚（）、氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鋅粉、氫氧化鈉、乙酸鉀（均為分析純）；蘆丁標

34、準品（純度）為公司產(chǎn)品。主要實驗儀器設(shè)備型超聲波破碎儀美國公司上海亞榮生化儀器廠上海實驗儀器廠有限公司特勒托利多儀器有限公司國華電器有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器電熱鼓風(fēng)干燥箱電子天平數(shù)顯恒溫水浴鍋型循環(huán)水式多用真空泵型微型螺旋混合儀型離心機型臺式恒溫振蕩器脫色搖床型分光光度計鄭州長城科公貿(mào)有限公司上海滬西分析儀器廠北京京立離心機有限公司上海躍進醫(yī)療器械廠江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器島津（）公司天津市泰斯特儀器有限公司上海岑達天平稱有限公司型中草藥粉碎機金馬牌一架盤天平廣西大掌碩士掌位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究實驗方法總黃酮含量的測定方法：（）比色法【黃酮類物質(zhì)在氧化劑亞硝酸鹽存在的情況下，可與硝

35、酸鋁生成黃色的黃酮鋁絡(luò)合物，在堿性環(huán)境下顯紅色，在可見區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。菱角殼提取物中總黃酮含量的測定采用（）比色法，以蘆丁為標準對照品，在波長處測定吸光度值，對照蘆丁標準曲線，計算提取物中總黃酮的含量。溶液的配制蘆丁標準品于干燥至恒重后，精密稱取，用甲醇溶解后移入容量瓶中并用乙醇定容至刻度，搖勻，制備成濃度為的標準品溶液備用。溶液：精確稱取，加入蒸餾水，使其充分溶解后轉(zhuǎn)移至容量瓶中備用。（）溶液：精確稱?。ǎ尤胝麴s水，使其充分溶解后轉(zhuǎn)移至容量瓶中備用。：準確稱取固體，溶解并移入容量瓶，定容至刻度備用。標準曲線的繪制準確移取配制好的蘆丁標準液、于具塞試管中，用甲醇補充至約，搖勻；加

36、入溶液，搖勻放置后，加入（）溶液，后，加入溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻，后，以試劑空白為參比，于處測吸光度值。用最乘法線性回歸，得出蘆丁含量（）與溶液吸光度之間的回歸方程。樣品中總黃酮含量的測定準確移取樣品于具塞試管中，用甲醇補充至約，搖勻；加入廣西大掌碩士掌位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究溶液，搖勻放置后，加入（）溶液，后，加入溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻，后，以試劑空白為參比，于處測吸光度值。根據(jù)標準曲線計算樣品總黃酮含量。樣品重復(fù)測定試驗分別取一提取液樣品按照方法進行重復(fù)測定六次，記錄吸光度值。此試驗用于評價測定方法的重現(xiàn)性和可靠性。加樣回收率試驗取已測定濃度為的樣品，按照一

37、定比例加入含量為的標準品，再進行檢測得出總黃酮含量。加樣回收率的計算方法為：加樣回收率：×本實驗采用的加樣回收率測定方法是向已知含量的樣品中加入、的蘆丁標準品，按含量測定的方法測定，分三組，做三個平行，計算平均回收率與實驗的相對標準偏差。顯色穩(wěn)定性試驗在實驗過程中，顯色時間的長短對樣品的吸光度影響較大，因此有必要對測定方法的顯色穩(wěn)定性進行試驗，找到適合的顯色時間。取同一濃度樣品溶液按照方法，自加入氫氧化鈉溶液之后每間隔分鐘測一次吸光度值。菱角殼總黃酮的提取工藝研究原料預(yù)處理選取新鮮無霉爛的野生小四角菱，去除果肉，將菱角殼清洗后置于。烘箱中烘干，用藥物粉碎機粉碎，過目篩后得菱角殼粉備用

38、。脂溶性物質(zhì)會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，有必要進行脫脂。稱取上述菱角殼粉加入石油醚（），超聲處理小時，抽慮；重復(fù)次，揮干石油醚，得到的脫脂樣品作為后續(xù)提取工藝試驗的樣品。提取溶劑的選擇準確稱取菱角殼粉份各，于三角瓶中，分別用水、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇為溶劑，以料液比比：，使用超聲波破碎儀功率檔，提取分鐘，抽慮，將濾液定容至容量瓶，按照方法進行總黃酮含量的測定。根據(jù)測定結(jié)果，綜合各種影響因素，以選取合適的溶劑作為菱角殼黃酮的提取溶劑。單因素實驗甲醇濃度對提取得率的影響準確稱取菱角殼粉份各，于三角瓶中，分別用、濃度的甲醇水溶液作為提取溶劑，以：的料液比，使用超聲波破碎儀功率檔，超聲提取分鐘

39、，處理結(jié)束后迅速抽慮，濾液定容至容量瓶中，待測。每組平行三次確定出最優(yōu)的提取濃度。時間對提取得率的影響準確稱取菱角殼粉份各，于三角瓶中，以的甲醇作為提取溶劑，以：的料液比，使用超聲波破碎儀功率檔，分別超聲提取、，處理結(jié)束后迅速抽慮，濾液定容至容量瓶中，待測。每組平行三次，確定出最優(yōu)的提取時間。料液比對提取得率的影響準確稱取菱角殼粉份各，于三角瓶中，以的甲醇作為提取溶劑，使用超聲波破碎儀功率檔，超聲波提取，考察不同料液比：、：、：、：、：對提取得率的影響，處理結(jié)束后迅速抽慮，濾液定容至容量瓶中，待測。每組平行三次，確定出最優(yōu)的提取料液比。功率對提取得率的影響準確稱取菱角殼粉份各，于三角瓶中，以甲

40、醇作為提取溶劑，以：的料液比，超聲提取分鐘，分別考察用超聲波破碎儀的五個功率檔對提取得率的影響（選用的型超聲波破碎儀最大功率為，功率可調(diào)范圍為一，含五個功率檔位），處理結(jié)束后迅速抽慮，濾液定容至容量瓶中，待測。每組平行三次確定出最優(yōu)的提取功率。正交試驗按照單因素實驗結(jié)果，設(shè)計四因素三水平（）正交表，以優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果與分析總黃酮含量的測定方法：（）比色法蘆丁標準曲線的繪制以方法繪制標準曲線，記錄的實驗數(shù)據(jù)見表表蘆丁含量與對應(yīng)的吸光度以吸光度為橫坐標，蘆丁含量為縱坐標，繪制標準曲線，如圖所示。用最小二乘法進行線性回歸分析得回歸方程為：式中：一蘆丁含量（）；一吸光度值，。為，在濃度范圍內(nèi)具有

41、良好的線性相關(guān)性。廣西大學(xué)碩士掌位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究樣品中總黃酮含量計算公式：丁：（）圖一標準曲線圖×樣品的總黃酮得率計算公式：（面萬五麗一）式中：×樣品中總黃酮的含量（），以蘆丁計；樣品的總黃酮提取得率；樣品溶液的吸光度；一樣液總體積，；測定時取樣體積，；樣品質(zhì)量，。樣品重復(fù)測定試驗取一提取液，按照方法測定，重復(fù)次。測定結(jié)果見表。結(jié)果表明所用的菱角殼總黃酮含量的測定方法具有較高的可靠性和重現(xiàn)性。表樣品重復(fù)測定試驗結(jié)果廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究樣品回收率試驗分別在已測含量的樣品液中添加一定比例的標準品蘆丁進行回收率試驗

42、。實驗結(jié)果見表實驗結(jié)果顯示平均回收率為，為。結(jié)論：所用的菱角殼總黃酮含量的測定方法準確度高。表加樣回收率試驗結(jié)果顯色穩(wěn)定性試驗實驗中發(fā)現(xiàn)樣品測定過程中吸光度值隨時間的增加會產(chǎn)生波動，因此對測定方法的顯色穩(wěn)定性進行試驗。圖顯色穩(wěn)定性曲線以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制顯色穩(wěn)定性曲線圖，如圖。結(jié)果表明：在添加氫氧化鈉之后的時間范圍內(nèi)，吸光度值比較穩(wěn)定，因此在加入氫氧化菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究鈉后的內(nèi)測定結(jié)果比較準確。菱角殼黃酮的提取工藝研究提取溶劑的選擇黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和來源一般不同，因而溶解性差別較大，應(yīng)依據(jù)極性和水溶性選擇合適的溶劑進行提取。目前，對苷類和極性較大的苷元常用一些極性較強的溶劑如水、甲醇、乙醇