聚合酶鏈反應(yīng)

1、 PCR引物的優(yōu)化設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction,PCR)通過(guò)多循環(huán)的變性、退火和延伸過(guò)程，能夠在時(shí)間內(nèi)獲得大量目的DNA片段，稱為一種無(wú)細(xì)胞分子克隆技術(shù)，已經(jīng)成為短生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室獲取目的DNA片段的常規(guī)方法。聚合酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction,PCR)是用于在體外酶促擴(kuò)增特定DNA片段的快速方法。像分子克隆技術(shù)一樣，PCR方法使得許多以前不可能的實(shí)驗(yàn)得以完成，PCR的應(yīng)用似乎是無(wú)止境的，并正在不斷地?cái)U(kuò)展，其中包括從基因組DNA和cDNA直接克隆目的基因，體外誘變和DNA工程，對(duì)法醫(yī)樣品進(jìn)行的遺傳指紋鑒定，傳染病原的分析，

2、遺傳疾病的產(chǎn)前診斷，基因的等位序列變異分析，RNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)的分析，基因組足跡分析以及對(duì)基因組DNA和cDNA進(jìn)行直接核苷酸序列測(cè)定。同時(shí)相關(guān)的技術(shù)也突飛猛進(jìn)地發(fā)展。 PCR方法的廣泛應(yīng)用及其相關(guān)的技術(shù)的順利進(jìn)行均離不開(kāi)PCR引物的合理設(shè)計(jì)?？梢哉f(shuō)，PCR引物的合理設(shè)計(jì)是任何PCR反應(yīng)能否進(jìn)行及其產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)率高低的關(guān)鍵。目前許多計(jì)算機(jī)軟件可用于引物的設(shè)計(jì)，但由于各種計(jì)算機(jī)軟件自身存在的局限性，其設(shè)計(jì)的引物并無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)者不同需要。目前最常用的是計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，即實(shí)驗(yàn)者根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)的原則并結(jié)合自己的經(jīng)驗(yàn)人工設(shè)計(jì)引物，然后選擇合適的軟件分析引物的合理性。引物設(shè)計(jì)原則：21 原則 PCR

3、引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的寡核昔酸片段，其中在擴(kuò)增的DNA片斷5端的引物對(duì)應(yīng)于有意鏈DNA序列，3端的引物對(duì)應(yīng)于無(wú)意鏈DNA序列，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。若這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開(kāi)它。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定需要擴(kuò)增的DNA序列，并知道其CDS區(qū)序列（編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū),即從起始密碼子區(qū)至終止密碼子區(qū)） ncbi網(wǎng)站查詢2. 選擇所需的載體,確定合適的酶切位點(diǎn)。 所選擇的酶切位點(diǎn)盡

4、量為多克隆位點(diǎn)的中間酶切位點(diǎn)，且載體上其它地方無(wú)該酶切位點(diǎn)。這樣連接以后再構(gòu)建新的質(zhì)粒時(shí)選擇酶的空間更大些。并保證所需擴(kuò)增的DNA序列中無(wú)該酶切位點(diǎn)（generunr分析）。4. 正向引物的設(shè)計(jì)4.1酶切位點(diǎn)的位置選擇。一般情況下都需要在引物的5，3端增加酶切位點(diǎn)，然后利用該酶將擴(kuò)增產(chǎn)物切下，接到相應(yīng)的載體上。A：擴(kuò)增的DNA用于表達(dá)時(shí)： (1) 自身有啟動(dòng)子。如果要利用自身的啟動(dòng)子，擴(kuò)增片段里應(yīng)包含啟動(dòng)子，所以酶切位點(diǎn)應(yīng)該在啟動(dòng)子前面?？稍谒鶖U(kuò)增的DNA序列的啟動(dòng)子前尋找是否有該酶切位點(diǎn)，若有則直接利用該酶切位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增；若無(wú)可尋找與其基本相似的位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。 (2) 擴(kuò)增片段里自身無(wú)啟動(dòng)子

5、。對(duì)于自身無(wú)啟動(dòng)子而又用于表達(dá)的基因序列，必須將其接于外源啟動(dòng)子的后面才能順利表達(dá)。在翻譯過(guò)程中，mRNA必須首先與核糖體相結(jié)合才能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。在原核生物中，mRNA分子上有兩個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是起始密碼子 AUG，另外一個(gè)是起始密碼子AUG上游3bp-11bp處的3bp-9bp的序列，后者由Shine J及Dalgarno L發(fā)現(xiàn)，故稱為SD序列。SD序列富含嘌呤核苷酸，而16S rRNA3端富含嘧啶核苷酸，二者剛好互補(bǔ)，可促進(jìn)mRNA核糖體結(jié)合，提高翻譯效率。因此，在基因重組過(guò)程中應(yīng)將結(jié)構(gòu)基因接于SD序列之后，以便為mRNA提供核糖體結(jié)合位點(diǎn)，提高基因表達(dá)效率。起始密碼子與SD序列

6、之間核苷酸數(shù)量變化過(guò)大會(huì)影響翻譯效率，所以應(yīng)該將目的基因的起始密碼子與啟動(dòng)子的ATG相重疊，這樣才能保證起始密碼子與SD序列之間核苷酸數(shù)量不改變，不影響翻譯效率。一般的啟動(dòng)子3斷酶切位點(diǎn)是NcoI（CCATGG）或Nde I(CATATG)，若添加的酶切位點(diǎn)為NdeI，引物的5端酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)為Nde I即可；若添加的酶切位點(diǎn)為NcoI時(shí),應(yīng)該根據(jù)目的基因起始密碼子后的堿基種類的不同選擇不同的酶切位點(diǎn)：如果該堿基是G，則可以直接設(shè)計(jì)為NcoI位點(diǎn)；如果該堿基不是G（如擴(kuò)增的目的基因?yàn)?-aagtcgtatg actaccgttc ccgatctcga-3）因?yàn)镹coI位點(diǎn)ATG后的G與DNA起始

7、密碼子后的a不配對(duì)，所以在設(shè)計(jì)引物的酶切位點(diǎn)時(shí)不能象上例簡(jiǎn)單地設(shè)計(jì)為NcoI。在處理這個(gè)問(wèn)題上有三種方法：一種是直接設(shè)計(jì)為NcoI位點(diǎn),其缺點(diǎn)是改變了閱讀框的第一個(gè)氨基酸，可能對(duì)表達(dá)會(huì)有影響；為了保證原始的閱讀框，可采取以下兩種方法：第二種方法是利用同尾酶連接法，即在保證起始密碼子及其后的堿基不改變的情況下選擇合適的酶切位點(diǎn)。如上例將引物的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)為tcatga（BspHI的酶切位點(diǎn)）,這樣既保證了閱讀框的atga堿基，又因?yàn)锽spHI與NcoI是同尾酶，所以可利用載體上的 NcoI位點(diǎn)與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的BspHI位點(diǎn)進(jìn)行連接；第三種方法是將酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)為末端三個(gè)堿基是目的基因起始密碼子后

8、的三個(gè)堿基的平末斷限制性內(nèi)切酶，然后將啟動(dòng)子的NcoI位點(diǎn)利用T4DNA Polymerase 補(bǔ)平，最后將二者連接，如上例可設(shè)計(jì)引物的酶切位點(diǎn)為agtact(ScaI位點(diǎn))。B：若擴(kuò)增的DNA用于阻斷.因?yàn)橹恍枰獢U(kuò)增出一定長(zhǎng)度的與染色體DNA同源的序列，所以對(duì)酶切位點(diǎn)的位置無(wú)特殊要求。只需要尋找與所需擴(kuò)增的DNA配對(duì)較好的區(qū)域作為酶切位點(diǎn)即可。4.2克隆PCR產(chǎn)物的方法之一，是在PCR產(chǎn)物兩端設(shè)計(jì)一定的限制酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切克隆到用相同酶切的載體上。但實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對(duì)裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷。必須在酶切位點(diǎn)旁邊加上一個(gè)至幾個(gè)保護(hù)堿基，才能使所定的限制性酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行有效切斷。加的個(gè)數(shù)

9、見(jiàn)Biolabs242所示，加的種類要和擴(kuò)增的DNA序列相匹配。如NdeI,Biolabs顯示在其酶切位點(diǎn)上加4個(gè)核苷酸時(shí)，酶切2小時(shí)，酶切效率達(dá)到50%，而加1個(gè)核苷酸時(shí)，酶切20小時(shí)酶切效率仍然為0%，所以應(yīng)在酶切位點(diǎn)前加4個(gè)核苷酸；4.3 在所添加的酶切位點(diǎn)后加17-30個(gè)與擴(kuò)增的DNA配對(duì)的核苷酸序列。4.4不同細(xì)胞對(duì)密碼子的使用頻率各不相同，密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)tRNA的豐富是一致的，密碼子使用頻率高意味著需要較多的相應(yīng)tRNA，二者之間的相互協(xié)調(diào)有利于細(xì)胞內(nèi)一些含量高的蛋白質(zhì)的順暢表達(dá)。同理，當(dāng)人們期望人工合成的基因能在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，也要選擇該細(xì)胞偏好的密碼子作為基因的密

10、碼子，這樣可以充分利用細(xì)胞內(nèi)豐富度高的tRNA，使基因得到高效表達(dá)。例如，大腸桿菌基因密碼子的使用情況：比較了大腸桿菌中13種含量較多的蛋白質(zhì)的密碼子使用情況發(fā)現(xiàn)這些高度表達(dá)的基因中密碼子的使用有以下規(guī)律：對(duì)于以C或U結(jié)尾的同義密碼子，如前兩個(gè)堿基為A、U，則第三個(gè)堿基優(yōu)先使用C；前兩個(gè)堿基為C、G，則第三個(gè)堿基優(yōu)先使用U。這樣的選擇有利于在翻譯時(shí)密碼子與反密碼子相互作用。所以對(duì)于需要異源表達(dá)的基因（如鏈霉菌基因要在大腸桿菌中表達(dá)），對(duì)引物起始密碼子以后的幾個(gè)密碼子要根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性進(jìn)行改變。5. 反向引物的設(shè)計(jì)(1) 擴(kuò)增的DNA用于表達(dá)時(shí)，要考慮終止密碼子的位置，所擴(kuò)增的片段里必須包括終

11、止密碼子 ，所以酶切位點(diǎn)應(yīng)該設(shè)計(jì)在終止密碼子后。酶切位點(diǎn)的選擇原理與5端一樣。(2) 當(dāng)擴(kuò)增的DNA用于阻斷時(shí)，與表達(dá)時(shí)相同，只是對(duì)酶切位點(diǎn)的位置選擇沒(méi)有太嚴(yán)格的要求。 二引物的設(shè)計(jì)后檢查 設(shè)計(jì)好的一對(duì)引物并非就是合理的，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析。由于在實(shí)際工作中，欲擴(kuò)增模板的條件不同以及實(shí)驗(yàn)的最終目的的不同，對(duì)引物的要求可能不一樣。有時(shí)已知條件很難滿足設(shè)計(jì)“合理”引物的要求。但在引物設(shè)計(jì)中應(yīng)盡量考慮到下列因素。1長(zhǎng)度 寡核昔酸引物長(zhǎng)度一般為1530bp，常用的是18-27 bp引物的有效長(zhǎng)度：In2(G十C)十(A十T)，引物過(guò)短會(huì)影響到擴(kuò)增的特異性，引物過(guò)長(zhǎng)至有效長(zhǎng)度In值38時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)的

12、最適延伸溫度會(huì)超過(guò)TaqDNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（74），（2 林萬(wàn)明著. PCR 技術(shù)操作與應(yīng)用指南. 北京:人民軍醫(yī)出版社,1993.）也無(wú)法保證產(chǎn)物的特異性。如果擴(kuò)增產(chǎn)物500bp，引物長(zhǎng)度為1618bp即可。若擴(kuò)增產(chǎn)物為45kb，引物最好不要少于24bp。引物3末端應(yīng)含有所研究基因特異序列中的1730bp。 2堿基分布的均衡性。引物中各種堿基最好分布均勻，G十C/A+T應(yīng)為50左右，G十C含量一般為4060。引物中應(yīng)避免嘌呤或嘧啶的堆積現(xiàn)象，避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的同一堿基，尤其3端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G十C富集序列區(qū)發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)。（2 林萬(wàn)明著. PCR 技術(shù)操作

13、與應(yīng)用指南. 北京:人民軍醫(yī)出版社,1993.）3引物的Tm值。 當(dāng)溫度升高到一定值后，雙鏈 DNA分子會(huì)解鏈為單鏈，這種溫度稱為解鏈溫度（melting temperature,Tm）。Tm值是指溶液中有半數(shù)的DNA分子解鏈為單鏈時(shí)的溫度。引物容易復(fù)性到模板上的溫度（退火溫度）是Tm值減去5-10，所以Tm值直接關(guān)系到PCR循環(huán)系統(tǒng)退火溫度的選擇。如果退火溫度過(guò)低，少數(shù)堿基形成的局部雙鏈不易解鏈，難以繼續(xù)碰撞找到正確的配對(duì)模板，故復(fù)性的特異性降低。如果退火溫度過(guò)高，則利于變性而不利于復(fù)性。太高的退火溫度使得引物復(fù)性到模板上，故不能有效地啟動(dòng)DNA的合成。若按公式Tm4×(G十C)十

14、2×(A十T)估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。兩條引物的Tm值盡可能相同，相差最好不要超過(guò)3。4. 引物二聚體。由于一般的DNA聚合酶在低溫下仍具有活性，因此常規(guī)PCR中反應(yīng)混合物內(nèi)引物與模板及引物自身可以部分發(fā)生非特異性復(fù)性，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增及引物二聚體多聚體的形成。二聚體可在兩個(gè)不同的引物分子之間形成，也可在兩個(gè)相同的引物分子之間形成，因此，在引物設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)盡可能地減少兩引物分子之間或一引物分子內(nèi)部有過(guò)多的互補(bǔ)堿基，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成，否則就會(huì)形成二聚體。二聚體分子中的兩條鏈互為模板，互為引物，引起引物擴(kuò)

15、增，導(dǎo)致模板擴(kuò)增失敗。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。另外在實(shí)際操作中，PCR反應(yīng)的熱啟動(dòng)(hot-start)也能有效防止引物二聚體的產(chǎn)生。使用熱啟動(dòng)PCR，即在高溫(70)下加入某種必需因子(通常為DNA聚合酶)。一方面通過(guò)擴(kuò)增前的加熱，使雙鏈模板充分解鏈；另一方面，通過(guò)高溫?zé)釂?dòng)反應(yīng)，促進(jìn)引物的特異性復(fù)性與延伸，增加有效引物的長(zhǎng)度，提高反應(yīng)的有效性與靈敏性，并減少引物二聚體多聚體的形成。在擴(kuò)增樣品數(shù)較少的情況下，一般采用先使模塊升溫后，再加酶的方法。如果擴(kuò)增樣品數(shù)較多，則應(yīng)選用熱啟始的酶。5 引物二級(jí)結(jié)構(gòu)。 引物二級(jí)結(jié)構(gòu)是指引物自身存在過(guò)多的互補(bǔ)序列，導(dǎo)致引物自身折疊成發(fā)

16、夾狀結(jié)構(gòu)而形成引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。如果很難完全避免引物分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，也要盡可能避免在引物3一端出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，3一端有二級(jí)結(jié)構(gòu)的引物是不能有效引發(fā)延伸的。由于分子內(nèi)的互補(bǔ)堿基比分子間的互補(bǔ)堿基更容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（因?yàn)榉肿泳嚯x更近），因此二級(jí)結(jié)構(gòu)比二聚體分子對(duì)PCR有更大的影響。6引物的3端。引物的延伸是從3端開(kāi)始的，3端不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR(ASPCR)反應(yīng)中，引物3端不能發(fā)生錯(cuò)配。引物3端的末位堿基對(duì)Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末

17、位堿基在錯(cuò)配 位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3 個(gè)堿基，因此應(yīng) 當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A34（ 3 朱平主編. PCR 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè). 北京: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社, 1992 4 鄭仲承. 寡核苷酸的優(yōu)化設(shè)計(jì)，生命的化學(xué), 2001,21(3):254-256. ）7. 引物的特異性。 一個(gè)好的引物在模板上的結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)該是唯一的，在非擴(kuò)增部位不應(yīng)再有結(jié)合位點(diǎn)的出現(xiàn)，只有這樣才能保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。一般情況下，引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。8密碼子的簡(jiǎn)并。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾，例如可

18、以對(duì)引物的5端修飾，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但3端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?端開(kāi)始的。特別應(yīng)注意的是3端不要終止于密碼子的第3位，因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。9引物的內(nèi)部穩(wěn)定性。引物的5端互補(bǔ)序列（不包括5端人為引入的非模板序列）應(yīng)該是相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而3端應(yīng)在堿基配對(duì)的基礎(chǔ)上盡可能為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)。換句話說(shuō)，3端應(yīng)該選用A 、T少選用G、C，這種引物有更高的引發(fā)效率，且能有效地避免假引發(fā)。這是因?yàn)椋?端為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)時(shí)，僅僅3一端的幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。只有在引物中部堿基和5一端堿基也都能與模板序列互

19、補(bǔ)結(jié)合時(shí)，才能有效的引發(fā)延伸。如果3一端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3一端的數(shù)個(gè)堿基與模板結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，從而造成假引發(fā)。G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定 性。應(yīng)當(dāng)選用3端G 值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5端和中間G 值相對(duì)較高的引 物。引物的3端的G 值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)6。（6 Oligo 軟件幫助文件(Oligo.HLP).）PCR反應(yīng)量的選擇:1. 如果要擴(kuò)增的模板是總DNA，則在PCR反應(yīng)前應(yīng)預(yù)先變性總DNA（即100水浴中煮沸510min），這樣才能保證模板的完全解鏈。2. 酶的選擇應(yīng)該根據(jù)不同的需

20、要及目的基因的特點(diǎn)選擇相應(yīng)的Taq酶。例如對(duì)于擴(kuò)增高GC的片段，應(yīng)使用LA Taq 酶，緩沖液也應(yīng)該用GC Buffer.3. 酶量的選擇酶量過(guò)多時(shí)易發(fā)生非特異性反應(yīng)；而酶量過(guò)少時(shí)，反應(yīng)性能下降。一般50ul的體系可使用2.5U的酶（即5U/ul,加0.5ul）4. 模板DNA的的選擇與用量PCR中的模板可以是來(lái)源于任何生物(包括動(dòng)物、植物、細(xì)胞及病毒等)的單鏈DNA及雙鏈DNA。RNA分子（如總RNA、mRNA、tRNA、rRNA病毒RNA等）亦可作為擴(kuò)增模板，但在作PCR擴(kuò)增之前，需要用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA）PCR對(duì)模板純度要求并不高。大量資料表明，樣品中存在一定量的蛋白質(zhì)或有機(jī)

21、物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。甚至可以將細(xì)胞裂解物直接用于擴(kuò)增。有DNA部分降解的樣品，也有可能作為樣品使用。，但前提是樣品中至少得有一個(gè)完整的靶序列分子。有時(shí)樣品中可能含有某種可抑制DNA多聚酶活性的雜質(zhì)，可通過(guò)高度稀釋來(lái)淡化雜質(zhì)對(duì)酶活性的抑制。只有在稀釋仍不能淡化雜質(zhì)對(duì)酶活性的抑制時(shí)才考慮對(duì)樣品進(jìn)行純化處理。PCR中，對(duì)于起始模板的用量，一般是總DNA為0.11 ug；片段DNA為0.110ng。5. 引物用量終濃度為0.11.0uM。引物濃度太低時(shí)，有時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物太少；引物濃度太高時(shí)，比較容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)。通常模板DNA的量較多或High complexity DNA(如總DNA)作模板時(shí)，引物濃度應(yīng)該低一些；當(dāng)模板DNA的量較少或Low complexity DNA（如plasmid等）作模板時(shí)，引物濃度應(yīng)高一些。6. dNTPS濃度各種dNTP濃度不可低于15uM,一般為50200uM,過(guò)高則易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，過(guò)低則產(chǎn)物量降低，且四種底物濃度應(yīng)完全相同，否則易產(chǎn)生錯(cuò)摻作用，降低反應(yīng)速率，提前終止延伸。7. 循環(huán)參數(shù)變性溫度及保溫時(shí)間以確保解鏈完全及不影響酶活性為度。退火過(guò)程應(yīng)選擇引物與模板易產(chǎn)生特異性結(jié)合的條件，溫度適當(dāng)提高，時(shí)間適當(dāng)縮短，則易于產(chǎn)生特異結(jié)合。反應(yīng)過(guò)程應(yīng)