數(shù)字PCR可行性分析

1、數(shù)字PCR可行性分析數(shù)字PCR技術的原理數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術不同，數(shù)字PCR采用絕對定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到廣泛的應用，這項技術在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結果驗證等諸多方面具

2、有的廣闊應用前景已經受到越來越多的關注。數(shù)字PCR采用的策略概括起來非常簡單，就是“分而治之”（divide and conquer）1，這種做法非常類似于計算機科學中的“分治算法”，將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板) ，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過陽性反應器的數(shù)目“數(shù)出”目標序列的拷貝數(shù)。在實際的數(shù)字PCR實驗中，事實上是通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反應器比例和數(shù)目進行統(tǒng)計學分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。圖1. 數(shù)字PCR的原理數(shù)字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標準曲

3、線就可以進行精確的絕對定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進行結果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術也特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。數(shù)字PCR技術的發(fā)展歷史從原理可以看出，數(shù)字PCR與傳統(tǒng)的定量PCR兩者皆定位于同樣的平臺基礎聚合酶鏈式反應和雙鏈DNA標記技術，但兩者采用的是完全不同的定量策略和思想方法， dPCR和qPCR并沒有實驗

4、方法和思路上的承繼關系，從這個角度來說，目前很多人把數(shù)字PCR稱為第三代PCR技術并不準確。在實時定量PCR技術成熟和發(fā)展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯醫(yī)學中心的科學家使用有限稀釋、PCR和泊松分布數(shù)據校正模型的方法（ limiting dilution, PCR and Poisson statistics），檢測了復雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因，進行了極其精細的定量研究2，雖然當時這種方法并沒有被冠以“數(shù)字PCR”之名，但已經建立了數(shù)字PCR基本的實驗流程，更重要的是了數(shù)字PCR檢測中一個極其重要的原則以“終點信號的有或無”（all-or-none end point

5、 ）作為判斷標志，這也是之后1999年Bert Vogelstein 和 Ken Kinzler將之命名為“數(shù)字PCR”(digital PCR)的主要原因3。數(shù)字PCR技術的原理非常簡單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應的載體，或者采用類似流式技術的磁珠乳液擴增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了第一臺商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國 Inostics&

6、#160;推出基于磁珠法乳濁液擴增和流式檢測方式的BEAMing dPCR 檢測服務，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據群體的體量上都無法達到更加精細的要求，時間和耗材成本嚴重限制了dPCR技術的發(fā)展。近幾年來，隨著納米制造技術和微流體技術（nanofabrication and microfluidics）的發(fā)展，數(shù)字PCR技術遇到了突破技術瓶頸的最佳契機。1997年Kalinina, 、Brown J, 和Silver J使用納升級芯片進行單克隆模板PCR擴增，獲得了美國專利，更重要的是這種采用“電浸潤法”進行納升級芯片制造技術顯露雛形4。伴隨二代測序技術發(fā)展起來的“油包水PCR”技術，可以一

7、次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，可以作為dPCR的樣品分散載體。QuantaLife 利用油包水微滴生成技術 開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術，這也是最早出現(xiàn)的相對成熟的數(shù)字PCR平臺，在運行成本和實驗結果穩(wěn)定性方面都基本達到了商品化的標準。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購，其微滴式數(shù)字PCR儀產品更名為QX100型號儀繼續(xù)在市場上銷售，這個早期型號為dPCR概念的普及和應用領域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級型號QX200。2012年，RainDance公司推出Raindrop型號數(shù)字PCR設備，這個設備將

8、其原有的二代測序文庫制備平臺技術平移到數(shù)字PCR技術平臺，在高壓氣體驅動下，將每個標準反應體系分割成包含100萬至1000萬個皮升級別微滴的反應乳液， 該公司的創(chuàng)始人之一Darren Link表示這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶“提供更高的檢測動態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品” 1。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)， 這也是目前數(shù)字PCR市場上最新型號的產品。采用高密度的納升流控芯片技術，樣本均勻分配至20,000個單獨的反應孔中。在整個工作流程中，樣本之間保持完全隔離 ，可以有效地防止樣品交叉污染，減少移液過程，簡化操

9、作步驟。同時芯片式設計避免了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問題5。數(shù)字PCR技術的應用領域從上世紀90年代以來qPCR技術的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測技術具有全新的面貌，而進入二十一世紀之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測序技術正在迅速發(fā)展，也是目前競爭最為激烈的研究領域之一，即使在這種情況下，dPCR技術仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學領域爭取到屬于自己的一席之地。1. 癌癥診斷檢測研究表明，腫瘤可能通過細胞壞死及凋亡從而釋放大量的基因組DNA進入人體系統(tǒng)循環(huán)，因此可以通過這些DNA分子的微衛(wèi)星DNA變化、易位、突變和甲基化等對癌癥進行檢測。近年來，數(shù)字PCR技術被廣泛應用到血液

10、、糞便等非侵入性樣本分析中，為癌癥的檢測提供新的途徑。 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)屬于酪氨酸激酶受體，它介導的信號轉導途徑調節(jié)細胞的生長、增殖和分化，大量研究表明，EGFR基因的突變或過表達會導致癌癥的發(fā)生。Yung等6利用數(shù)字PCR技術研究非小細胞性肺癌病人血漿和腫瘤中第19外顯子框內缺失和第21外顯子L858R突變兩種ERFR突變體，通過微流體系統(tǒng)對35份血漿樣本進行檢測，兩種突變類型檢出率分別為17%和26%，該結果與對腫瘤樣本的測序相比，其靈敏度和特異性分別達到92%

11、與100%。隨后，Wang等7也將數(shù)字PCR檢測應用到肺癌基因組中EGFR異常的檢測中，得出了相同的結論，即數(shù)字PCR能夠對EGFR突變具有靈敏的檢測與精確的定量，適用于肺癌的診斷，對預測治療反應、監(jiān)測病情進程及早期抗藥性診斷等提供了非常有利的分析手段。     在對結腸癌的研究中，Taly等8采集19位病人的血液樣本，通過數(shù)字PCR分析結果顯示其中14例樣本檢測到KRAS基因突變，1例檢出與腫瘤樣本不一致的突變，另外5例則檢測不到，同時其中5例BRAF V600E突變型全部檢測出來。Qi等9則利用數(shù)字PCR對直腸癌病人的糞便樣本進行

12、mRNA定量分析，在8例病人組織和9例糞便樣本中的檢出率分別達100%和77%。2. 產前診斷（prenatal diagnosis） 產前診斷又稱宮內診斷，是指胎兒出生前采用遺傳學和影像學等各種檢測方法預測其是否有先天性疾病，是預防染色體病患兒出生的主要措施。傳統(tǒng)的產前診斷采用侵入性診斷（invasive prenatal diagnosis）方法，主要包括孕中期的胎兒羊水的產前診斷、臍血的產前診斷，目前常用的取材手術主要有絨毛膜絨毛取樣，羊膜腔穿刺，臍帶血穿刺等，但這些方法對母體和胎兒均有一定的創(chuàng)傷并存在胎兒丟失風險。而非侵入性產前診斷(non-in

13、vasive prenatal diagnosis, NIPD)則采用了無創(chuàng)傷的技術方法避免了以上的安全威脅，成為當下引起廣泛關注的診斷方法。1997年，Lo等采集孕婦血液進行研究，利用PCR的方法擴增Y染色體特異片段并出現(xiàn)陽性信號，證明母體血液中存在胎兒的DNA10，自此拉開了NIPD研究的序幕。但是，從大量母體DNA中成功檢測到胎兒游離DNA的過程中存在相當大的難度，需要提高檢測方法的靈敏度和特異性。2007年，Lo等利用數(shù)字PCR技術發(fā)展了兩種策略用于產前診斷胎兒21三體綜合癥，其一稱之為digital RNA-SNP，檢測胎盤細胞特異表達即完全來

14、自胎兒的21號染色體上PLAC4 mRNA的SNP位點的比例；其二為digital RCD法，檢測孕婦血液中21號染色體與1號染色體的相對含量，可以檢測到血液中25%的胎兒基因11。Lun等12比較了數(shù)字PCR與實時定量PCR、質譜檢測三者的靈敏度，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR比其他兩種方法更為精確，因此，數(shù)字PCR檢測到胎兒基因的濃度可能要高于預期。隨著研究的深入，數(shù)字PCR被證明比傳統(tǒng)技術方法具有更高的臨床靈敏度和特異性，未來該技術在產前診斷領域將越來越被廣泛地應用。 3. 稀有突變分析在基因組變異研究領域，群體基因組水平上的SNP（Single Nucleotide Po

15、lymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測面臨的問題主要是突變序列往往與大量正常序列同時存在，競爭性反應嚴重影響突變序列的檢測精度，數(shù)字PCR技術帶來的極高的擴增特異性在稀有突變檢測方面具有天然的優(yōu)勢，在癌癥標志物檢測、無創(chuàng)產前檢查、線粒體突變檢測等研究方向上，我們已經看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。稀有突變檢測對癌癥研究具有重大意義。原癌基因或腫瘤抑癌基因的突變累積是促進腫瘤發(fā)生的一個重要因素。極少量體細胞的上述突變即足以促進癌癥發(fā)生或發(fā)展。由于上述突變通常只存在于極少量的細胞中，因此需要使用具有高信噪比和低假陽性率的Assay。常用的SNP基因分型技術(如毛細管電泳或實時熒光定量PCR)是最高

16、效的突變檢測方法，可以檢測突變率不低于20% (約五分之一細胞)的突變細胞。但是，數(shù)字PCR能夠從野生型背景中鑒別出突變基因，具有更高的靈敏度和精度。數(shù)字PCR通過將樣本分到芯片的數(shù)千個單獨的PCR反應中，大大降低了某個反應中的總分子數(shù)，從而有效地富集目標序列，并稀釋了野生型背景。4. 拷貝數(shù)變異（CNV）鑒定拷貝數(shù)變異 (CNV) 是基因座的野生型拷貝數(shù)相比參考基因組增加或減少造成的基因組失衡。這些基因組改變從小的 (小于 10 kb) 插入或缺失到大的(超過1 Mb)、復雜的多等位基因復制均有。CNV 是人類基因組中最常見的遺傳變異，與多種疾病有關，包括癌癥或遺傳性疾病易感性 13, 14

17、。因此，我們需要簡單可靠的方法定量CNV，用作潛在的生物標記物，并用于了解腫瘤形成的分子機制。目前的 CNV 評估方法如表1所示。這些方法包括原位雜交，但該方法耗時、費力且結果分析具有主觀性15。陣列比較基因組雜交 (aCGH) 可以提供更高的精度，但該方法需要大量的操作時間且分辨率取決于所需的陣列類型 16。最近，下一代測序技術的進步使得通過單次運行即可經濟高效地檢測多種類型的遺傳變異成為可能17。最后，在目前所有方法中，實時熒光定量和數(shù)字 PCR 技術提供了最簡單的工作流程，可以獲得準確的拷貝數(shù)結果，且操作時間極短，周轉時間較快。 HER2 (人表皮生長因子2，又稱為ERBB2) 是一種原

18、癌基因，在特定的情況下會促進癌癥細胞的增殖。原癌基因促進腫瘤發(fā)生的機制有三種：(1) 染色體重排導致超活性基因融合，(2) 編碼序列上的點突變或缺失導致超活性蛋白生成，(3) 基因擴增導致蛋白質過表達。HER2基因擴增多年來一直被視作早期乳腺癌預后不佳的指標之一，亦是選擇早期和晚期癌癥最佳治療方案的關鍵因素 (例如，使用赫賽汀Herceptin® 進行HER2蛋白靶向治療) 目前，原位熒光雜交 (FISH) 和銀染原位雜交(SISH) 是用于預后情況和藥物有效性評估的常規(guī)方法。但是上述方法存在諸多缺點，包括冗長繁瑣的染色和切片制備過程、需要專業(yè)的技術培訓、檢測成本較高。同時傳統(tǒng)方法在

19、某些具有挑戰(zhàn)性的情況下進行結果判斷時會引入一定程度的主觀因素?；始宜_里郡醫(yī)院致力于探索采用數(shù)字 PCR (dPCR) 作為SISH的替代方法用于HER2拷貝數(shù)檢測，以改善技術和成本。數(shù)字 PCR 將樣本模板分散到眾多單獨的 PCR 反應器中，其中一部分反應器含有目標分子 (已擴增)，另一部分則不含有目標分子 (未擴增，稱為陰性)。PCR 擴增后，利用陰性反應部分計算樣本中目標分子的絕對數(shù)量，無需參照標準品，可實現(xiàn)對目標 DNA 分子的絕對定量。因此，相比目前用于評估 HER2 基因擴增的SISH 方法，該技術能夠降低主觀性，提升標準化水平，而且可節(jié)省超過75%的成本。5. MicroRNA前體

20、定量越來越多的證據表明，microRNA是參與幾乎所有生物學過程的基本元件。成熟microRNA可介導microRNA依賴性的基因沉默。盡管microRNA前體是microRNA生物發(fā)生和加工的基礎，但現(xiàn)有的大多數(shù)檢測方法仍致力于成熟microRNA的檢測，針對microRNA前體的檢測卻很少。microRNA前體檢測面臨的挑戰(zhàn)主要歸因于其較低的豐度、必須使用參照轉錄本，以及序列相似性造成的干擾。Life Technologies開發(fā)的基于硅芯片的QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)可以大大提升mir-9初級前體轉錄本檢測的精確度。檢測原代神經細胞培養(yǎng)物中同一microRNA的3個不同的

21、前體-miR-9 (pri-miR-9-1、-2和-3)，結果顯示，采用QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)可以輕松克服傳統(tǒng)microRNA前體檢測方法面臨的挑戰(zhàn)。研究證明短期和長期酒精暴露，可以觸發(fā)培養(yǎng)細胞中miR-9前體的變化。檢測可重復性極高，精度范圍為1.26-2.33%。其中一種miR-9前體嵌于蛋白質編碼的mRNA轉錄本內，而其他兩種前體則是長的非編碼轉錄本，這些結果說明了數(shù)字PCR (dPCR)方法的通用性。數(shù)字PCR的市場前景數(shù)字PCR是近年來迅速發(fā)展起來的一種定量分析技術。迄今為止,已有Fluidigm、Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字PCR產品,這些產品已經在單

22、細胞分析、癌癥早期診斷和產前診斷等研究領域顯示出巨大的技術優(yōu)勢和應用前景。根據全球知名咨詢公司Frost & Sullivan的研究分析師Karolina Olszewska表示：“dPCR的高靈敏度讓它成為多個應用的理想選擇，包括拷貝數(shù)變異、稀有突變檢測以及核酸序列的絕對定量。數(shù)字PCR因其精確性、重復性以及在診斷和制藥應用上的潛力而引起了行業(yè)的極大關注。在這一高速增長、前景廣闊的市場，Bio-Rad在數(shù)字PCR上的投資是富有成效的?！睋﨔rost &Sullivan預計，2011-2016年間數(shù)字PCR儀器市場將以52%的年均復合增長率增長。Frost & Sull

23、ivan發(fā)布的美國qPCR和dPCR儀器市場的分析報告指出，美國的實時定量PCR和數(shù)字PCR儀器市場正處在不同的增長階段，但兩者都保持競爭活力。盡管qPCR市場很成熟，但其競爭力正在擴張，因為幾個大牌的生命科學公司進入此市場，希望擴展它們的基因組學流程方案。同時，新興的dPCR市場也在快速增長，早期采用者增加，而供應商也在擴展技術應用，以拓寬應用范圍。dPCR作為一項新技術，儀器定價仍然較高，讓很多實驗室望而卻步。dPCR目前的客戶僅限于制藥和生物技術公司，以及一些資金充裕的大型科研實驗室。據DeciBio預計, 2016年生命科學儀器市場預計$458億,中國是最強驅動力。一個高增長的技術領域

24、是數(shù)字PCR，該技術的復合增長率將飆升至90%，從2011年1000萬美元升至2016年2.5億美元。數(shù)字PCR的操作步驟2013年下半年，Life-technologies推出的QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)采用最簡單的工作流程，只需極少的手工操作步驟和極短的操作時間。該系統(tǒng)的核心是一塊包括20000個反應孔的硅芯片，每塊芯片運行一個樣本，在一次實驗中可同時分析兩個靶點。每個QuantStudio 3D芯片試劑盒包括12塊芯片及蓋子、12個上樣刮板和3個浸液注射器及針頭。PCR預混液的制備與實時熒光定量PCR反應相同，將TaqMan Assay、DNA或cDNA樣本以及預混液加入

25、一支試管內混勻（步驟1）。此外，QuantStudio 3D芯片是獨立包裝的一次性耗材，可最大程度降低樣本受到污染的危險。上樣刮片也是一次性使用，簡化了芯片上樣過程。制備好反應混合物后，使用自動芯片加載系統(tǒng)上樣，打開加載系統(tǒng)，將打開的芯片放置于上樣底座上（步驟2）；將上樣刮片置于加載系統(tǒng)臂的固定裝置上（步驟3）；將芯片蓋子放置于儀器轉臂的固定裝置上（步驟4）；將反應混合物加至上樣刮片（步驟5）；按下按鈕，分配器自動將反應混合物分配至芯片的20000個反應孔內（步驟6），然后密封芯片（步驟7）（芯片密封劑可以在紫外光下發(fā)生固化，密封劑經自動上樣設備上的紫外裝置激活，對芯片進行密封）；密封后可以在

26、帶有雙平板模塊的熱循環(huán)儀上對芯片進行擴增，在熱循環(huán)儀上進行擴增需要約2個半小時（步驟8）；QuantStudio3D 數(shù)字PCR系統(tǒng)一次讀取一塊芯片（步驟9），需要30秒完成讀數(shù)（在芯片讀取過程中，儀器讀取芯片唯一的標識符，捕獲擴增樣本的熒光信號，芯片讀數(shù)中會捕獲所有反應孔的ROX、FAM和VIC通道熒光圖像，數(shù)據輸出為FAM和VIC通道的計數(shù)（拷貝數(shù)/微升）；通過ROX信號確認反應孔中是否存在樣本）；最后，將數(shù)據寫至用戶定義的目標位置儀器、USB驅動器、聯(lián)網服務器等，使用QuantStudio3D AnalysisSuiteTM現(xiàn)有的軟件模塊，可以對實驗結果進行進一步的數(shù)據和圖像分析。步驟1

27、步驟2步驟3步驟4步驟5步驟6步驟7-1 步驟7-2步驟8-1步驟8-2步驟8-3步驟9Fluidigm公司2006年底推出的Bio-Mark基因分析系統(tǒng)由Bio-Mark實時PCR系統(tǒng)（整合了高性能計算機）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（將生物樣品、反應試劑導入到IFC微液流芯片中）和數(shù)據分析軟件四部分構成。IFC微液流芯片有2種：Dynamic Array（48.48動態(tài)芯片和96.96動態(tài)芯片）和Digital Array（12.765數(shù)字芯片和48.770數(shù)字芯片）。數(shù)字芯片將預混液（樣品與PCR試劑）分成數(shù)百個單獨的PCR反應，開展數(shù)字PCR分析。整個過程分

28、為五步：準備芯片；將每個樣品預混液移液至芯片的獨立入口；將芯片放入IFC Controller，利用軟件界面迫使分析組分進入單獨的反應板；將芯片放入BioMark系統(tǒng)，開展熱循環(huán)和熒光檢測；利用分析軟件來查看和分析擴增曲線。與上面兩者相比，浙大的SPC芯片系統(tǒng)（圖2）采用自吸式分液進樣芯片，進樣方法簡便，無需外源動力。ZJU 自吸式分液進樣芯片既是耗材又有自動分配反應液的功能。相當于簡化了QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)的步驟2-步驟7，也無需像Fluidigm公司一樣利用IFC Controller儀器進樣。圖2 ZJU 自吸式分液進樣芯片成本分析數(shù)字PCR的流程比傳統(tǒng)的qPCR更

29、簡單，但通量較低，基本每塊芯片上千個反應單元都是針對單一樣本的分析，而熒光檢測技術的局限性限制了多個芯片的同時檢測。結論生物學的基礎研究和分子技術的前進伴隨著更精確和更靈敏的測量技術發(fā)展。dPCR具有測量獨立性與無需任何校準物的特點。因此，該技術是潛在的核酸測量基準方法，并從原理上為核酸計量提供了保證19。相比其他方法，dPCR作為絕對定量方法能準確定量目標DNA和提供可靠的定量數(shù)據4。商業(yè)化dPCR儀器(如Fluidigm公司的BioMarkSystem)的大量出現(xiàn)進一步推動和擴大了該技術的發(fā)展和應用范圍。參考文獻：1. M Baker.(2012). Digital PCR hits it

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