動物布魯氏菌病診斷技術(shù)GB分享

1、真誠為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請指正。動物布魯氏菌病診斷技術(shù) GB/T1864620021范圍    本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物布魯氏菌病的診斷技術(shù)。    本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的虎紅平板凝集試驗、乳牛全乳環(huán)狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病的監(jiān)測及診斷泌乳母牛布病的初篩試驗；試管凝集試驗和補體結(jié)合試驗適用于診斷羊種、牛種和豬種布病感染的家畜。    本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的試管凝集試驗不適用于犬種和綿羊副睪種布病感染家畜的檢疫。2虎紅平板凝集試驗2.1材料準(zhǔn)備2.1.1抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清由制標(biāo)單位提供，按

2、說明書使用。2.1.2受檢血清應(yīng)新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和無腐敗氣味。2.1.3潔凈的玻璃板，其上劃分成4cm2的方格。2.1.4吸管或分裝器，適于滴加0.03mL。2.1.5牙簽或火柴桿，供攪拌用。2.2操作方法2.2.1將玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號，然后加相應(yīng)血清0.03mL。2.2.2在受檢血清旁滴加抗原0.03mL。2.2.3用牙簽類小棒攪動血清和抗原使之混合。2.2.4每次試驗應(yīng)設(shè)陰、陽性血清對照。2.3判定2.3.1在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定。2.3.2受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽性(+)，無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性()。

3、3乳牛布病全乳環(huán)狀試驗3.1材料準(zhǔn)備3.1.1布病全乳環(huán)狀抗原    由制標(biāo)單位提供，按說明書使用。3.1.2乳樣3.1.2.1受檢乳樣須為新鮮的全乳。3.1.2.2采乳樣時應(yīng)將母畜的乳房用溫水洗凈、擦干，然后將乳液擠入潔凈的器皿中。3.1.2.3采集的乳樣夏季時應(yīng)于當(dāng)日內(nèi)檢查；保存于2時，7d內(nèi)仍可使用。3.2操作方法3.2.1取乳樣lml，加于滅菌凝集試驗管內(nèi)。3.2.2取充分振蕩混合均勻的全乳環(huán)狀抗原1滴(約50ul)加人乳樣中充分混勻。3.2.3置37一38水浴中60min。3.2.4加溫后取出試管勿使振蕩，立即進行判定。3.3判定  

4、  標(biāo)準(zhǔn)分為：    a)強陽性反應(yīng)(+)，乳柱上層乳脂形成明顯紅色的環(huán)帶，乳柱白色，臨界分明；    b)陽性反應(yīng)(+)，乳脂層的環(huán)帶呈紅色，但不顯著，乳柱略帶顏色；    c)弱陽性反應(yīng)(+)，乳脂層的環(huán)帶顏色較淺，但比乳柱顏色略深；    d)疑似反應(yīng)(±)，乳脂層的環(huán)帶顏色不明顯，與乳柱分界不清，乳柱不褪色；    e)陰性反應(yīng)()，乳柱上層無任何變化，乳柱顏色均勻。4動物布病試管凝集試驗4.1材料準(zhǔn)備4.1.1稀釋液

5、    0.5%石炭酸生理鹽水。檢驗羊血清時用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液，如果血清稀釋用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋應(yīng)用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液。4.1.2抗原、陽性血清和陰性血清由制標(biāo)單位提供，按說明書使用。4.1.3凝集試驗管(三分管)、試管架、吸管及溫箱。    4.2操作方法4.2.1按常規(guī)方法采血分離血清。4.2.2運送和保存血清樣品時防止凍結(jié)和受熱，以免影響凝集價。若3d內(nèi)不能送到實驗室，按每9mL血清加1ml 5%石炭酸生理鹽水(徐徐加入)防腐，也可用冷藏方法運送血清。4.2.3受檢血清的稀釋&#

6、160;   以羊和豬為例，每份血清用4支凝集試管。4.2.3.1第一管標(biāo)記檢驗編碼后加1.15mL稀釋液。4.2.3.2第24管各加入0.5mL稀釋液。4.2.3.3然后用1ml吸管取被檢血清0.1mL；加入第1管內(nèi)，并混合均勻。混合方法是將該試管中的混合液吸人吸管內(nèi)，再沿試管壁吹入試管中，如此吸入、吹出34次，充分混勻后以該吸管吸混合液0.25ml棄去，4.2.3.4取0.5mL混合液加入第2管，用該吸管如前述方法混合。4.2.3.5再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液0.5mL。4.2.3.6稀釋完畢，從第1至第4管的血清稀釋度

7、分別為1：125、1：25、1：50和1：100。4.2.3.7牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是第一管加1.2mL稀釋液和0.05mL被檢血清。4.2.3.8將0.5mL20倍稀釋的抗原加入已稀釋好的各血清管中，并振搖均勻，羊和豬的血清稀釋則依次變?yōu)?：25、1：50、1：100和1：200，牛、馬和駱駝的血清稀釋度則依次變?yōu)?：50、1：100、1：200和1：400。    大規(guī)模檢疫時也可只用2個稀釋度，即牛、馬、鹿、駱駝用1：50和1：100，豬、山羊、綿羊和狗用1：25和1：50。4.2.3.9 置3740溫箱24h，取出檢查并記錄結(jié)果。

8、4.2.3.10每次試驗均應(yīng)設(shè)陽性血清、陰性血清和抗原對照，即    a)陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血清同。    b)陽性血清對照：陽性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與受檢血清同。    c)抗原對照：1：20稀釋抗原液0.5mL，再加0.5mL稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。4.3判定4.3.1供判定參照比濁管制備方法見附錄E(提示的附錄)。4.3.2結(jié)果判定4.3.2.1凝集反應(yīng)程度分為：    參照比濁管，按各試管上層液體清亮度判讀 

9、;   a)+菌體完全凝集，100下沉，上層液體100清亮；    b)+菌體幾乎完全凝集，上層液體75清亮；    c)十十菌體凝集顯著，液體50清亮；    d)+凝集物有沉淀，液體25清亮；    e)凝集物無沉淀，液體均勻混濁。4.3.2.2牛、馬、鹿和駱駝1：100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1：50血清稀釋，出現(xiàn)“+”以上凝集現(xiàn)象時，受檢血清判定為陽性。   4.3.2.3牛、馬、鹿、駱駝1：50血清稀釋，豬、山羊、綿羊、狗

10、1：25血清稀釋，出現(xiàn)“+”以上凝集現(xiàn)象時，受檢血清判定為可疑反應(yīng)。    可疑反應(yīng)家畜經(jīng)3周一4周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽性。豬和馬經(jīng)重檢仍保持可疑水平，而農(nóng)場的牲畜沒有臨床癥狀和大批陽性患畜出現(xiàn)，該畜被判為陰性。    豬血清偶有非特異性反應(yīng)，須結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查判定，必要時應(yīng)配合補體結(jié)合試驗和鑒別診斷，排除耶森氏菌交叉凝集反應(yīng)。5動物布病補體結(jié)合試驗5.1材料準(zhǔn)備5.1.1 稀釋液：0.85生理鹽水按常規(guī)方法配制。5.1.2 綿羊紅細(xì)胞懸液：采取成年公綿羊血，按常規(guī)方法脫纖、洗滌、離心，用稀釋液洗滌34次，最后二次以2

11、000r/min離心沉淀lOmin，取下沉的紅細(xì)胞泥，以稀釋液配制成2.5紅細(xì)胞懸液。5.1.3  抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清、溶血素由制標(biāo)單位提供，按說明書使用。5.1.4        受檢血清：收集和處理見附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)。5.1.5        溶血素：效價測定見附錄B(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)。5.1.6        補體：采集及其效價測定方法見附錄C(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)。5

12、.1.7        抗原：效價測定見附錄D(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)。5.2操作方法5.1.7.1            將1：10稀釋經(jīng)滅能(見附錄A)的受檢血清加入2支三分管內(nèi)，每管0.5mL。5.1.7.2    其中一管加工作量抗原0.5mL，另一管加稀釋液0.5mL。5.1.7.3         

13、;   上述2管均加工作量補體，每管0.5mL，振蕩混勻。5.1.7.4            置37一38水浴20min，取出放于室溫(22一25)。5.1.7.5            每管各加2單位的溶血素0.5mL和2.5紅細(xì)胞懸液0.5mL。充分振蕩混勻。5.1.7.6      

14、0;     再置37一38水浴20min，之后取出立即進行第一次判定。5.1.7.7            每次試驗需設(shè)陽性血清、陰性血清、抗原、溶血素和補體對照。主試驗各要素添加量和順序如表1。表1布魯氏菌病補體結(jié)合試驗的主試驗                  &

15、#160;                    mL血清被檢血清對照管陽性血清陰性血清抗原溶血素補體血清加入量0.50.50.50.50.50.5000稀釋液00.500.500.501.51.5抗原0.500.500.501.000工作量補體0.50.50.50.50.50.50.500.53738水浴20min二單位溶血素0.50.50.50.50.50.50.50.5025紅細(xì)胞0.50.50.50

16、.50.50.50.50.50.53738水浴20min判定結(jié)果舉例+  5.3判定5.1.7.8第一次判定，要求不加抗原的陽性血清對照管，不加或加抗原的陰性血清對照管，抗原對照管呈完全溶血反應(yīng)。5.1.7.9初判后靜置12h作第二次判定，第二次判定時要求溶血素對照管，補體對照管呈完全抑制溶血。5.1.7.10對照正確無誤即可對受檢血清進行判定，受檢血清加抗原管的判定參照標(biāo)準(zhǔn)比色管記錄結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)比色管的制備方法見附錄F(提示的附錄)。5.1.7.1判定標(biāo)準(zhǔn)：    040%溶血判為陽性反應(yīng)；    50%一90%溶

17、血判為可疑反應(yīng)；    100%溶血判為陰性反應(yīng)。牛、羊和豬補體結(jié)合反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)均相同。 附錄A（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）受檢血清的采集和處理 以常規(guī)方法采血和分離血清。用稀釋液（5.1.1）將血清作1：10稀釋，按表B1規(guī)定的水浴滅能。表A1   各種被檢動物血清的滅能溫度和時間血清類別滅能溫度/滅能時間/min羊585930馬585930驢、騾636430黃牛、水牛、豬565730鹿、駱駝5430附錄B（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）溶血素效價測定B1 稀釋溶血素    取0.2ml含等量甘油防腐的溶血素，加9.8mL稀

18、釋液配成1：100的基礎(chǔ)稀釋液，按表B1方法作進一步稀釋。表B1  溶血素稀釋法                                     ml管號12345678910111：100稀釋溶血素0.20.10.10.

19、10.10.10.10.10.10.10.1稀釋液0.80.91.41.92.42.93.43.94.44.95.4溶血素稀釋倍數(shù)5001000150020002500300035004000450050005500B2  按表B2加入各成份，而后3738水浴20min。B3  溶血素效價從水浴中取出，立即判定結(jié)果，用1：20補體0.5mL，在3738水浴20min，能使2.5%紅細(xì)胞液0.5mL完全溶血的最小量溶血素為溶血素效價或稱一單位溶血素。以表B2為例，對照管均不溶血，16管完全溶血，測定溶血素效價為3000倍。    在主試驗時溶血素

20、的工作效價為滴定效價的倍量或稱二單位溶血素，則工作效價為1500倍稀釋。    效價測定后，23個月內(nèi)可按此效價使用，不必重測。表B2  溶血素效價測定表                      ml管號1234567891011對照管溶血素補體稀釋液溶血素稀釋倍數(shù)50010001500200025003000350040004500500055

21、00100  加入量0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.500稀釋液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.51.52.01:20補體0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.500.502.5%紅細(xì)胞0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.53738水浴20min結(jié)果（例）          +    +    +  

22、  +完全溶血部分溶血完全不溶血                  附錄C（規(guī)范性附錄）補體采集及其效價測定C.1補體采集    選擇健康豚鼠35只，于使用前一天早晨飼喂前或停食后6h從心臟采血，分離血清后混合保存于普通冰箱中，也可從獸醫(yī)生物藥品廠購買凍干補體，使用前加稀釋液恢復(fù)原量后使用。C.2補體效價測定    每次補體結(jié)合試驗，應(yīng)于當(dāng)日測定補

23、體效價。C.2.1稀釋補體并加各種成份    用稀釋液配制1:20稀釋補體，按表C1加入各種成份后，前后經(jīng)373820min水浴2次。C.2.2補體效價    經(jīng)過2次水浴，在2單位溶血素存在情況下，陽性血清加抗原的試管完全不溶血，而在陽性血清未加抗原及陰性血清無論有無抗原的試管發(fā)生完全溶血所需最小補體量，就是所測得的補體效價。以表C1為例，第6管1：20稀釋的補體0.25mL即為一個補體單位。表C1   補體效價測定        &

24、#160;                           ML管號12345678910對照1112131：20補體加入量0.100.130.160.190.220.250.280.310.340.370.500稀釋液加入量0.400.370.340.310.280.250.220.190.160.131.51.52.0工作量抗原加

25、入量(不加抗原量加稀釋液)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5000振蕩均勻后置3738水浴20min二單位溶血素0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.500.502.5%紅細(xì)胞懸液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5振蕩均勻后置3738水浴20min結(jié)果陽性血清加抗原+陽性血清不加抗原+   陰性血清加抗原+   陰性血清不加抗原+   C.3原補體使用時應(yīng)稀釋倍數(shù)的計算    原補體使用

26、時應(yīng)稀釋倍數(shù)按式（C1）計算：                                      補體稀釋倍數(shù)原補體稀釋倍數(shù)=         

27、;             ×使用時每管加入量        （C1）                          

28、0;             測得效價                                 20    以表C1為例，

29、按公式計算            ×0.5=40倍。                                0.25    即此例補

30、體應(yīng)作40倍稀釋，每管加0.5Ml，即為一個補體單位?？紤]補體性質(zhì)不穩(wěn)定，操作過程中效價會降低，正式試驗時使用濃度比補體效價要大10%左右，本例補體工作單位作1：36稀釋，每管使用0.5mL。 附錄D（規(guī)范性附錄）抗原效價測定    一般按照獸醫(yī)制藥廠產(chǎn)品說明書的效價使用。在初次使用或過久等其他原因需要測定時按下述步驟進行。D.1須取用兩份陽性血清（分別為強陽性和弱陽性血清）和一份陰性血清來測定抗原效價。D.2陰性血清和陽性血清稀釋    用稀釋液對陰性對照血清僅作1：10稀釋，陽性血清稀釋成1：10、1：25、1：50、1

31、：75和1：100，5個稀釋度。D.3稀釋抗原    用稀釋液將抗原稀釋成1：10、1：50、1：75、1：100、1：150、1：200、1：300、1：400和1：500等稀釋度。D.4按表D1加入各種成份，并經(jīng)373820min水浴2次。表D1  布魯氏菌補體結(jié)合抗原效價測定                ML管號123456789對照1011抗原稀釋倍數(shù)加入量105075100150200300400500補體對照溶血素對照0.50.50.50.50.50.50.50.50.500各種血清稀釋度加入量0.50.50.5