分子生物組檢測程序性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、1 目的確立分子生物組檢測程序性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，使檢測程序性能驗(yàn)證操作規(guī)范化。2 適用范圍采用基因擴(kuò)增檢驗(yàn)方法檢測的所有項(xiàng)目。3 職責(zé)或責(zé)任人3.1 組長負(fù)責(zé)組織本組工作人員具體實(shí)施，并審核報(bào)告；3.2 本組工作人員負(fù)責(zé)對適用范圍內(nèi)的檢測程序進(jìn)行驗(yàn)證操作，并撰寫報(bào)告；3.3 技術(shù)主管負(fù)責(zé)監(jiān)督本規(guī)程的實(shí)施；3.4 質(zhì)量主管參與對檢驗(yàn)程序有效性的評價(jià)及指導(dǎo)；3.5 檢驗(yàn)科主任負(fù)責(zé)批準(zhǔn)檢測程序的實(shí)施。4 內(nèi)容定量檢測方法和程序的分析性能驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括精密度、正確度、線性、測量和/或可報(bào)告范圍、抗干擾能力等。定性檢測項(xiàng)目驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括測定下限、特異性、準(zhǔn)確度（方法學(xué)比較或與金標(biāo)準(zhǔn)比較）、抗

2、干擾能力等。4.1 正確度指該檢測程序測定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度。4.1.1 驗(yàn)證方法：本組采用對照試驗(yàn)，將衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心或湖北省臨床檢驗(yàn)中心的能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評的質(zhì)控品、或已獲認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)本作為樣品，以所用的檢測程序?qū)M(jìn)行定量分析，分析結(jié)果與質(zhì)控品靶值或比對實(shí)驗(yàn)室檢測值進(jìn)行比較，誤差在可接受范圍即可接受。4.1.2 樣品數(shù)量：至少5份，包括正常和異常水平或不同常見基因突變型；4.1.3 頻率：至少每年2次；4.1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)：對于定性試驗(yàn)，陰陽性應(yīng)該一致；對于定量試驗(yàn)，應(yīng)有A80%勺結(jié)果符合要求，衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心能力和湖北省臨床檢驗(yàn)中心驗(yàn)證評價(jià)界限靶值分別為和，實(shí)驗(yàn)室間

3、結(jié)果比對合格標(biāo)準(zhǔn)是偏倚<±%。4.2 特異性指在可能其它成分（如其他病原體、內(nèi)源物質(zhì)等）存在的條件下，采用的方法能正確測定待測物的特性。對于核酸檢測的特異性，主要是指核酸擴(kuò)增過程中的特異性。4.2.1 驗(yàn)證方法：取一份陰性標(biāo)本，加入其他常見病原體高濃度核酸樣本，進(jìn)行10次獨(dú)立的檢測。4.2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)：觀察并記錄檢測結(jié)果為陰陽性的差異。4.3 精密度指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。一般以偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。4.3.1 驗(yàn)證方法4.3.1.1 重復(fù)精密度（批內(nèi)精密度）：選擇具有醫(yī)學(xué)決定水平的高低值標(biāo)本，按規(guī)定的操作方法，

4、在較短得時間內(nèi)及穩(wěn)定的條件下各作20次獨(dú)立測定。計(jì)算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。標(biāo)本可用患者血清或選用質(zhì)控品進(jìn)行，所檢測所有數(shù)據(jù)超出2SD的數(shù)據(jù)不能超過2個，否則應(yīng)分析失控原因糾正后重新進(jìn)行試驗(yàn)。（可參照廠家說明書）4.3.1.2 中間精密度（批間精密度）：選擇室內(nèi)質(zhì)控作為衡量中間精密度的依據(jù)。選取至少2個月的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)（濃度最好為醫(yī)學(xué)決定水平之內(nèi)和之外）計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。4.3.1.3 重復(fù)精密度（批內(nèi)精密度）與中間精密度（批間精密度）：連續(xù)測定5d,每天一個分析批，每批高低兩個濃度水平，每一個濃度水平同一樣品重復(fù)測定3次。如果因?yàn)橘|(zhì)量控制程序或操作問題判斷一批為失控，應(yīng)剔除數(shù)據(jù)，并增

5、加執(zhí)行一個分析批；正常使用每日質(zhì)控品。計(jì)算批內(nèi)和批間標(biāo)準(zhǔn)差。4.3.2 判定標(biāo)準(zhǔn)：批內(nèi)精密度CV喊小于3/5總允許誤差（TEa）;批間精密度CV%應(yīng)小于4/5總允許誤差（TEa）；如果批內(nèi)精密度、批間精密度小于允許范圍的，驗(yàn)證通過；如果批內(nèi)精密度、批間精密度大于驗(yàn)證值，精密度驗(yàn)證未通過，重新驗(yàn)證或與廠家聯(lián)系并取得幫助。4.4 檢出限是限度試驗(yàn)的參數(shù)，指試樣中被測物能被檢測出的最低量。定量分析的檢出限必須經(jīng)過分析適量的在檢出限附近的樣品或分析按檢出限條件配制的樣品的方法進(jìn)行驗(yàn)證。4.4.1 驗(yàn)證方法：選定一份濃度接近制造商聲明的檢出限的樣本，或采用高值樣本用陰性血清進(jìn)行稀釋，進(jìn)行20次獨(dú)立測定。

6、4.4.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性率應(yīng)A95%符合要求。4.5 定量限指樣品中被測物能被定量測定的最低值，其結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。定量分析的定量限必須經(jīng)過分析適量的在定量限附近的樣品或分析按定量限條件配制的樣品的方法進(jìn)行驗(yàn)證。4.5.1 驗(yàn)證方法：選定一份濃度在線性范圍下限左右的樣本，或采用高值樣本用陰性血清進(jìn)行稀釋，進(jìn)行20次獨(dú)立測定。4.5.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)：分析檢測結(jié)果的SD值,符合要求。4.6 線性和測量/可報(bào)告范圍：線性指在檢測范圍內(nèi)，測試結(jié)果與被測物濃度呈正比關(guān)系的程度。4.6.1 驗(yàn)證方法：取評價(jià)項(xiàng)目的高、低值病人標(biāo)本各一份，（高值標(biāo)本為接近線性范圍上限或略超過線性上限的標(biāo)本，低值

7、標(biāo)本為檢測陰性的標(biāo)本）。用低值標(biāo)本對高值標(biāo)本按1:10的比例進(jìn)行倍比稀釋，配制成系列濃度梯度的血清，使檢出限上的點(diǎn)至少不得少于5個。每個樣本標(biāo)本重復(fù)測定3次，記錄結(jié)果。所有樣品應(yīng)在一次運(yùn)行中或幾次間隔很短的運(yùn)行中隨機(jī)測定，最好在一天之內(nèi)完成。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，剔除離群值，單個離群值可直接由數(shù)據(jù)組中剔除并進(jìn)行重測，全部樣本無需重新測定。如發(fā)現(xiàn)多個離群值或數(shù)據(jù)點(diǎn)過于分散，需檢查造成此誤差的可能原因，對可能原因進(jìn)行糾正后，對全部樣本進(jìn)行重新測定。求出3次測定結(jié)果的平均值和每一稀釋度的預(yù)期值。以實(shí)測均值為X，以預(yù)期值為Y,在初步判斷無離群值后，使用EXCELS件進(jìn)行二元一次的回歸分析。4.6.2 判斷方法：數(shù)

8、據(jù)擬合為直線，所有數(shù)據(jù)幾乎均落在一條直線上，相關(guān)系數(shù)R為符合要求?；蚩梢罁?jù)制造商聲明的標(biāo)準(zhǔn)。否則，應(yīng)重新進(jìn)行線性驗(yàn)證。4.7 測量/可報(bào)告范圍測量范圍指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。4.7.1 驗(yàn)證方法：同中的線性，其線性范圍即為測量范圍。4.7.2 判斷方法：當(dāng)肝炎系列核酸檢測線性范圍足夠?qū)挄r，其范圍即可成為其臨床可報(bào)告范圍。因?yàn)楫?dāng)上述驗(yàn)證的熒光定量PCRt核酸檢測檢測試劑盒說明書中檢測程序的線性范圍很寬時，高濃度已屬臨床高載量患者，符合抗病毒治療指標(biāo)，不必要對更高的載量進(jìn)行精確檢測；若結(jié)果低于檢測限，已為臨床療效監(jiān)測效果較好的指標(biāo)，大量研究表明，此群患者對抗病毒治療不敏感，因此對療效監(jiān)測意義不大，如果的確需要更低更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，則建議采用更敏感的檢測方法。4.8 抗干擾能力血液樣本內(nèi)源產(chǎn)物血紅蛋白、膽紅素和甘油三酯會對核酸的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致標(biāo)本溶血、黃疸及脂血時檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。4.8.1 驗(yàn)證方法：采用回收試驗(yàn)，分別在5個已知分析物濃度的樣品中加入不同干粉或液體干擾物，達(dá)到制造商聲明的干擾物濃度后進(jìn)行檢測、分析。4.8.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)：至少4個樣品測量結(jié)果與分析物預(yù)期濃度偏倚<±%時，