共聚焦（無圖）ppt課件

1、-書面實驗報告：書面實驗報告：1 如何判別共聚焦圖片的熒光質(zhì)量？如何判別共聚焦圖片的熒光質(zhì)量？2 影響共聚焦圖像質(zhì)量的硬件要素有哪些？影響共聚焦圖像質(zhì)量的硬件要素有哪些？請同窗們撰寫好實驗報告后，下次實習前由請同窗們撰寫好實驗報告后，下次實習前由各班班長收齊并交給中心擔任教學的王教各班班長收齊并交給中心擔任教學的王教師處！師處！光電倍增管光電倍增管檢測針孔檢測針孔光源針孔光源針孔光源光源分色鏡分色鏡物鏡物鏡樣本樣本聚集平面聚集平面評判熒光樣品制備能否有勝利，可從以下幾個方面考量：評判熒光樣品制備能否有勝利，可從以下幾個方面考量：1熒光標志反響的特異性和熒光信號定位準確性熒光標志反響的特異性和熒

2、光信號定位準確性2堅持樣品的構(gòu)造形狀的完好性和免疫活性堅持樣品的構(gòu)造形狀的完好性和免疫活性3熒光信號的呼應準確、靈敏、具有可反復性熒光信號的呼應準確、靈敏、具有可反復性4熒光強度熒光強度5熒光穩(wěn)定性熒光穩(wěn)定性6熒光信號的分布的一致性熒光信號的分布的一致性7兩種及兩種以上熒光信號之間熒光光譜交叉，即串色性兩種及兩種以上熒光信號之間熒光光譜交叉，即串色性8背景噪聲干擾性背景噪聲干擾性影響獲取圖像質(zhì)量主要的共聚焦參數(shù)：影響獲取圖像質(zhì)量主要的共聚焦參數(shù)：1 1檢測針孔檢測針孔Detector Pinhole Detector Pinhole 2 2激光功率激光功率(Power) (Power) 3 3

3、聲光控制器聲光控制器 AOTF-Acousto Optic Tunable Filter) AOTF-Acousto Optic Tunable Filter)4 4光電倍增管增益及靜噪控制光電倍增管增益及靜噪控制PMT Gain & PMT OffsetPMT Gain & PMT Offset5 5反復掃描反復掃描- -數(shù)字減噪數(shù)字減噪Li.A.Li.A.、Aver.Aver. 6 6掃描圖分辨率掃描圖分辨率FormatFormat: : 除此以外除此以外 物鏡物鏡ObjectiveObjective、 掃描速度掃描速度Scan SpeedScan Speed 掃描方向掃描

4、方向Unidirectional Scan / Bidirectional ScanUnidirectional Scan / Bidirectional Scan (X-Direction) (X-Direction) 數(shù)碼放大數(shù)碼放大Zoom InZoom In Pin=0.2Pin=1Pin=2025502550255Li.A=0Li.A=0Aver=0Aver=0Li.A=0Li.A=0Aver=0Aver=0Li.A=2Li.A=2Aver=2Aver=2Li.A=2Li.A=2Aver=0Aver=0SpeedZoom1X2X4X8X16X32X64Xothers二二 固定組織時應

5、留意固定組織時應留意 :應力求堅持組織新穎，勿使其枯燥，盡快固定處置；應力求堅持組織新穎，勿使其枯燥，盡快固定處置；組織塊不宜過大過厚，必需小于組織塊不宜過大過厚，必需小于2cmXl.5cmx0.3cm，尤，尤其是組織塊厚度必需控制在其是組織塊厚度必需控制在0.3cm以內(nèi)；以內(nèi)；固定液必需有足夠的量，在體積上普通大于組織固定液必需有足夠的量，在體積上普通大于組織20倍以上，倍以上，否那么組織中心固定不良影響效果；否那么組織中心固定不良影響效果；組織固定后應充分水洗。組織固定后應充分水洗。 三薄片樣本三薄片樣本Thin Samples對于單層培育的細胞，組織切片等較薄的樣品，主要是對于單層培育的

6、細胞，組織切片等較薄的樣品，主要是獲取高分辨率的圖像，由于介質(zhì)薄，因此折射系數(shù)的匹配問獲取高分辨率的圖像，由于介質(zhì)薄，因此折射系數(shù)的匹配問題不像厚樣品那么重要，故此可以用甘油作為介質(zhì)的物鏡題不像厚樣品那么重要，故此可以用甘油作為介質(zhì)的物鏡63XGlyc、100XOil。四厚片樣本四厚片樣本Thick Samples對于厚樣本對于厚樣本202mm在運用中應留意：在運用中應留意：蓋玻片要貼緊樣本，不要留有空隙，以免任務間隔不夠產(chǎn)生蓋玻片要貼緊樣本，不要留有空隙，以免任務間隔不夠產(chǎn)生象差；象差；采用任務間隔足夠長的物鏡采用任務間隔足夠長的物鏡10X、20X或或40X，不可以，不可以用油鏡，油鏡的任務

7、間隔短，會頂破蓋玻片，損壞樣本，用油鏡，油鏡的任務間隔短，會頂破蓋玻片，損壞樣本，甚至物鏡，且成像也不明晰；甚至物鏡，且成像也不明晰；進展斷層成像會有熒光損失，從而影響圖像的質(zhì)量，采取提進展斷層成像會有熒光損失，從而影響圖像的質(zhì)量，采取提高檢測針孔高檢測針孔Pinhole1(AU),添加激光穿透性；添加激光穿透性；在進展在進展“Continuous掃描時，找到最亮的層面進展調(diào)焦調(diào)掃描時，找到最亮的層面進展調(diào)焦調(diào)整相應參數(shù)。整相應參數(shù)。五玻片處置和涂膠五玻片處置和涂膠 對易呵斥細胞、組織脫片的問題采取以下兩措施，可防止對易呵斥細胞、組織脫片的問題采取以下兩措施，可防止脫片景象出現(xiàn)。脫片景象出現(xiàn)。

8、 1載玻片和蓋玻片處置新載玻片上有油污，必需經(jīng)過清潔載玻片和蓋玻片處置新載玻片上有油污，必需經(jīng)過清潔液浸泡液浸泡1224h，流水充分漂洗后用蒸餾水清洗，流水充分漂洗后用蒸餾水清洗5遍以上，浸遍以上，浸泡在泡在95酒精內(nèi)酒精內(nèi)2h，用綢布擦干或用紅外線烤箱烤干均可，用綢布擦干或用紅外線烤箱烤干均可，貯放于玻片盒內(nèi)備用。蓋玻片很薄，以上處置程序必需縮短，貯放于玻片盒內(nèi)備用。蓋玻片很薄，以上處置程序必需縮短，清潔液浸泡只需清潔液浸泡只需2h，流水沖洗留意勿損傷玻片等。不主張用，流水沖洗留意勿損傷玻片等。不主張用烘烤箱枯燥。烘烤箱枯燥。 2.載玻片上涂多聚賴氨酸液粘附劑；載玻片上涂多聚賴氨酸液粘附劑；

9、六自發(fā)熒光六自發(fā)熒光Autofluorescence首先看它時什么顏色？在何部位，與靶區(qū)有何關聯(lián)？能否首先看它時什么顏色？在何部位，與靶區(qū)有何關聯(lián)？能否是雜質(zhì)？所選擇的熒光染料與之必需不同；是雜質(zhì)？所選擇的熒光染料與之必需不同；亮度如何？假設太亮需求避開、減弱；亮度如何？假設太亮需求避開、減弱；能否需求它？通常情況下，有助于確定染色區(qū)的定位；能否需求它？通常情況下，有助于確定染色區(qū)的定位；來源何處？葉綠體、卵黃、膠原蛋白、還是其他的來源？來源何處？葉綠體、卵黃、膠原蛋白、還是其他的來源？淬滅、漂白；淬滅、漂白；蘇丹黑可以淬滅脂質(zhì)的自發(fā)熒光；蘇丹黑可以淬滅脂質(zhì)的自發(fā)熒光；組織內(nèi)的自發(fā)熒光可以被硼氫化鈉淬滅。組織內(nèi)的自發(fā)熒光可以被硼氫化鈉淬滅。組織自發(fā)熒光淬滅劑組織自發(fā)熒光淬滅劑 AutoFluo Quencher AutoFluo Quencher 1 1、固定：、固定：2 2、能否需求切片？、能否需求切片？ 激發(fā)的穿透力為激發(fā)的穿透力為50-500um50-500um 取決于熒光探針對組織的浸透才干。取決于熒光探針對組織的浸透才干。 免疫熒光標志的樣本：用震蕩切片機切厚片免疫熒光標志的樣本：用震蕩切片機切厚片3 3、透明、透明 酒精脫水酒精脫水 二甲苯透明二甲苯透明 二甲苯二甲苯+ +少量中性樹膠濕封少量中性樹膠濕封4 4