第六章掃描電子顯微鏡的樣品制備技術(shù)

1、 SEM對樣品基本要求：l基本性質(zhì)：干凈干凈、干燥、導(dǎo)電干燥、導(dǎo)電、不發(fā)光、 不發(fā)熱、磁性弱。l大 小：直徑最大不宜超過10 mm，高度在3-5 mm之間，在滿足觀察的情況下，樣品盡量小為宜。l對試樣的要求試樣可以是塊狀塊狀或粉末顆粒粉末顆粒，試樣大小要適合儀器專用樣品座的尺寸，不能過大。樣品座尺寸各儀器不盡相同，一般小的樣品座為 3 5mm ，大的樣品座為 30 50mm ，以分別用來放置不同大小的試樣，樣品的高度也有一定的限制，一般在 5 10mm 左右。l表面受到污染的試樣，要在不破壞試樣表面結(jié)構(gòu)的前不破壞試樣表面結(jié)構(gòu)的前提提下進行適當(dāng)清洗，然后干燥。l新斷開的斷口或斷面，一般不需要進行

2、處理，以免破壞斷口或表面的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。有些試樣的表面、斷口需要進行適當(dāng)?shù)那治g，才能暴露某些結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，則在侵蝕后應(yīng)將表面或斷口清洗干凈，然后烘干。l要求在真空中能保持穩(wěn)定，含有水分的試樣應(yīng)先干燥除去水分。l對磁性試樣要預(yù)先去磁，以免觀察時電子束受到磁場的影響。l要求導(dǎo)電，不導(dǎo)電的觀察前進行導(dǎo)電處理。l塊狀試樣塊狀試樣掃描電鏡的試樣制備是比較簡便的。對于塊狀導(dǎo)電塊狀導(dǎo)電材料，除了大小要適合儀器樣品座尺寸外，基本上不需要進行什么制備，用導(dǎo)電膠把試樣粘結(jié)在樣品座上，即可放在掃描電鏡中觀察。對于塊狀的非導(dǎo)電或?qū)щ娦暂^差塊狀的非導(dǎo)電或?qū)щ娦暂^差的材料，要先進行鍍膜處理，在材料表面形成一層導(dǎo)電膜。以避免電荷積

3、累，影響圖象質(zhì)量。并可防止試樣的熱損傷。l粉體可以直接撒在樣品座的雙面碳導(dǎo)電膠上，用平的表面物體，例如玻璃板壓緊，然后用洗耳球吹去粘結(jié)不牢固的顆粒。l對細(xì)顆粒的粉體分析時，特別是形貌觀察時，將粉體用酒精或水在超聲波清洗機內(nèi)分散，再用滴管把均勻混合的粉體滴在樣品座上，待液體烘干或自然干燥后，粉體靠表面吸附力即可粘附在樣品座上。l在制備在制備SEM樣品時，必須掌握以下原則：樣品時，必須掌握以下原則：l(1)每一操作過程，都應(yīng)注意防止樣品的污染和損傷，使被觀察的樣品盡可能保持原有的外貌和微細(xì)結(jié)構(gòu)；l(2)去除樣品內(nèi)水份，以利于維持SEM的真空度和防止鏡筒的污染。但在脫水和干燥處理時，要盡量減少避免樣

4、品體積變小和收縮變形等人工假象；l(3)降低樣品表面的電阻率，增加樣品的導(dǎo)電性能，以提高二次電子發(fā)射率，建立適度的反差和減少樣品的充放電效應(yīng)；l(4)觀察組織細(xì)胞的表面或內(nèi)部微結(jié)構(gòu)，應(yīng)注意和保護樣品的觀察面。 l制備過程如下：l取材 根據(jù)需要，切取適當(dāng)大小的樣品。專門的SEM備有靈活可動，范圍較大的樣品臺，樣品可大些。裝在透射電鏡上的掃描附件，活動范圍較小，樣品直徑應(yīng)在34mm左右。l漂洗 用緩沖液把組織表面洗凈，否則會影響正常形態(tài)，但以快速和輕巧為宜，盡量保護器官或組織的表面結(jié)構(gòu)，使其不致因不慎的操作造成人為損傷。l固定 用2.55戊二醛/緩沖液在室溫或4攝氏度下前固定。具體時間可根據(jù)樣品的

5、需要而定，一般單細(xì)胞10-30分鐘，較大的或較硬的樣品可達(dá)1-2h或更長時間。l漂洗 用緩沖液洗3次，洗去未結(jié)合的戊二醛。l重固定 1鋨酸/緩沖液4攝氏度下后固定1060min。有時為了提高樣品的反差和固定效果，可以綜合固定液，如隨意選用戊二醛、多聚甲醛、鋨酸等按照不同的比例混合使用。l漂洗 用緩沖液洗去未結(jié)合的鋨酸。l脫水 用30、50、70、80、90、95、100、100丙酮或乙醇溶液各10-15分鐘，大于1mm的樣品可脫水1020分鐘。l干燥 一般情況下，可把脫水后的樣品放在空氣中自然干燥或45熱風(fēng)吹干。有些研究工作要求盡量完好保存樣品表面的精細(xì)結(jié)構(gòu)，可用真空干燥法、冷凍干燥法和臨界點

6、干燥法等使樣品干燥。這些方法都比空氣干燥法效果好，其中臨界點干燥法優(yōu)點多，多被研究工作者采用。l導(dǎo)電 ：離子濺射、真空鍍膜或?qū)щ娙旧幚韑樣品的固定：為了把生物樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)和外部形態(tài)真實的保留下來，SEM樣品必須進行固定處理。通過固定還可以使組織硬化，從而增強樣品在干燥過程中耐受表面張力變化發(fā)生龜裂，還能提高樣品耐受電子束轟擊的能力。常用的固定劑為醛類和四氧化鋨，還有多聚甲醛和高錳酸鉀等。固定的方式有浸泡固定、灌注固定、微波和化學(xué)混合固定。l脫水處理：對保證金屬鍍膜裝置和電鏡的鏡筒真空度和防止樣品在高真空狀態(tài)下的龜裂和變形等有重要的作用。采用不同濃度的乙醇或丙酮梯度脫水逐步的除去樣品中的水分

7、。l1. 自然干燥法：自然干燥法：把樣品暴露在空氣中直接干燥，只適用于表面比較堅硬或含水分較少的生物樣品。如：昆蟲、骨骼、牙齒、毛發(fā)、種子、果殼、花粉、植物標(biāo)本，以及微小材料如細(xì)菌等。具體做法是：先將樣品固定，并系列脫水到100，在大氣中讓脫水劑自然揮發(fā)即可，但注意環(huán)境要干燥。因為脫水劑的表面張力系數(shù)比水小所以樣品在脫水劑中不會過多變形而影響其結(jié)構(gòu)。l2. 真空干燥法真空干燥法：是直接將固定及脫水的樣品放入真空鍍膜儀內(nèi)，在低真空狀態(tài)下使樣品內(nèi)的溶液逐步揮發(fā)，當(dāng)達(dá)到高真空時樣品即可干燥，隨后進行金屬鍍膜。這一方法簡單易行，但是仍存在一定的表面張力問題，固在缺少其它的干燥手段時才選用。l3 臨界點

8、干燥臨界點干燥：目前最理想的簡單的干燥法。臨界點干燥儀利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下液體表面張力逐漸被消除的特性，減少樣品干燥過程中的變形和收縮，從而達(dá)到樣品的完全干燥。l4 冷凍干燥冷凍干燥：在此過程中，樣品中的水分直接由冰態(tài)升華為氣態(tài)，樣品也不受表面張力的影響。但這種方法的不足之處是樣品中的水分易形成冰晶而破壞超微結(jié)構(gòu)。 臨界點：臨界點：在一定的溫度和壓力一定的溫度和壓力下，某物質(zhì)的液態(tài)和氣態(tài)界液態(tài)和氣態(tài)界面消失面消失，由液態(tài)瞬間瞬間轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，此時的溫度即該物質(zhì)的臨界點溫度（C.T），同時也是該物質(zhì)的臨界點（C.P）。而此時的壓力和該物質(zhì)的密度稱為臨界壓力和臨界密度。不同的物質(zhì)有各自的臨界點和臨界

9、壓力。在在臨界點時表面張力作用消失，分子之間的內(nèi)聚力等于零臨界點時表面張力作用消失，分子之間的內(nèi)聚力等于零。臨界點干燥儀的設(shè)計就依據(jù)了這種物理性質(zhì)。 干燥劑：干燥劑：考慮到生物樣品有限的承受力，一般選擇低溫和低壓臨界點的干燥劑.有多種物質(zhì)可以作為臨界點干燥的干燥劑，如：液態(tài)二氧化碳、干冰（固體二氧化碳）、氟利昂以及一氧化二氮。最常用的為液態(tài)二氧化碳。干燥劑臨界溫度/攝氏度一氧化二氮氟利昂13氟利昂23液態(tài)二氧化碳、26.528.925.931.1臨界壓力（kg/cm2）標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下71.238.247.772.8l在干燥過程中，表面張力會使樣品變形。因此，為了保持樣品的完好形態(tài)，必須消除表面張

10、力造成的影響。我們知道，液體表面張力隨其溫度的升高而急驟變小。對于每一種液體，都有一個表面張力為零的溫度，這個溫度叫臨界溫度表面張力為零的溫度，這個溫度叫臨界溫度。與臨界溫度對應(yīng)的壓力叫臨界壓力，在臨界溫度和臨界壓力下使樣品干燥的方法叫臨界點干燥法?，F(xiàn)在，國內(nèi)外都有商品臨界點干燥儀。l照理，含水樣品可以直接進行臨界點干燥?？墒?，由于水的臨界溫度高達(dá)臨界溫度高達(dá)374，臨界壓力高達(dá)，臨界壓力高達(dá)2.4710Pa(218個大氣個大氣壓壓)，這樣高的溫度和壓力不僅會破壞樣品的形態(tài)構(gòu)造，而且需要耐壓很高的儀器。解決這個問題的辦法就是選擇臨界溫度接近室溫，臨界壓力接近大氣壓的液體取代樣品中的水，然后對這

11、種液體進行臨界點干燥，使樣品達(dá)到干燥的目的。這種液體叫做轉(zhuǎn)移液轉(zhuǎn)移液。對轉(zhuǎn)移液的要求，除要求其適當(dāng)?shù)呐R界溫度和臨界壓力外，還應(yīng)考慮其毒性、密度、成本和溶劑性質(zhì)等，一般常用液體CO2。l樣品固定后系列乙醇脫水到100。l中間液替換中間液替換：因為樣品要從脫水劑乙醇經(jīng)中間液過渡到轉(zhuǎn)移液。因此，中間液既要和脫水劑互溶，又要和轉(zhuǎn)移液互溶。具體步驟是：脫水后的樣品在70乙醇與30醋酸異戊酯混合液中浸1020分鐘，然后再在30乙醇與70醋酸異戊酯混合液中浸1020分鐘，而后用100中間液(醋酸異戊酯)浸兩次，每次各1020分鐘。l轉(zhuǎn)移液替換轉(zhuǎn)移液替換：用CO2作轉(zhuǎn)移液替換中間液的過程，是在封閉的耐壓室內(nèi)進

12、行的。用酒精或丙酮清洗臨界點干燥器的進氣管道和耐壓室，吹干后，反復(fù)12次放入和排出液體CO2，然后在耐壓室底部放數(shù)層濾紙，并將裝有樣品的樣品架放入。擰緊耐壓室蓋，慢慢放入液體CO2。然后稍開排氣閥，以5L/min的流量排出耐壓室原來的氣體，此時可聞到醋酸異戊酯味，待醋酸異戊酯味消失后，關(guān)閉排氣閥。l此時通過觀察窗觀察室內(nèi)液體CO2應(yīng)浸沒樣品(如果不能浸沒樣品，說明耐壓室溫度高，應(yīng)降溫后再行操作)，關(guān)閉進氣閥，停放約12小時以完成CO2的置換過程。此時壓力約為5.6166.46Pa(5765Kgf/cm2)。 l加熱：加熱：用60溫水或自動調(diào)溫裝置將耐壓室加溫，壓力很快增加，使壓力維持在1.11

13、7Pa(110Kgf/cm2)左右。510分鐘，CO2全部汽化，從觀察窗可看到其汽化過程是：液面上升界面模糊完全混濁透亮無液體。這時的壓力約為9.36Pa (95Kgf/cm2)。l排氣：排氣：在排氣管口放一溫水杯，這樣既可觀察排出的氣泡數(shù)以控制排氣速度，又可避免排氣管路產(chǎn)生干冰而造成堵塞。慢慢打開排氣閥，使壓力緩慢下降，并維持耐壓室溫度在50左右。排氣速度不可太快，否則會損傷樣品，一般控制在10泡/秒左右約每分鐘45Pa9.8 5Pa(510Kgf/cm2)的降壓速度。大約經(jīng)一個多小時的排氣后，壓力表指示為“零”，排氣口無氣泡時，即可打開耐壓室，取出已干燥好的樣品。 l1.樣品干燥不充分：這

14、是最常見的問題，可能有以下幾種原因：l（1）脫水不徹底，中間液醋酸異戊酯和液態(tài)二氧化碳置換不良，最終導(dǎo)致干燥不充分。l（2）醋酸異戊酯反流：在冬季反復(fù)使用儀器，可能使醋酸異戊酯凝結(jié)在排氣管上。如果此時打開樣品室蓋，由于氣壓的變化，會使排氣管中的醋酸異戊酯反流，并浸濕已干燥好的樣品。解決的辦法是沿樣品室的內(nèi)壁墊上一層濾紙，用來吸附反流的醋酸異戊酯。l（3）一次干燥的樣品過多：樣品籠的高度一般以不超過樣品室深度的一般為宜。否則樣品過多，帶入的醋酸異戊酯也過多樣品不易干燥充分。2.樣品室內(nèi)壓力達(dá)不到要求：l（1）注入液態(tài)二氧化碳量過少：可能會使樣品位于二氧化碳的氣液面交界處，樣品受到液體二氧化碳表面

15、張力的作用，盡管比水的表面張力小的多，但仍會影響樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。l（2）樣品室密閉不良：這可能是因為墊圈老化，有裂紋，或墊圈下有異物等。3.注入液體二氧化碳困難：主要因為樣品室的溫度高，沒有事先降溫。夏季室溫高于30度時更易造成注入困難。降溫的辦法有兩種：一是用少許液體二氧化碳充盈2-3次，再放掉氣體的二氧化碳；二是用控溫鈕調(diào)制低于室溫10度。l在冷凍干燥過程中，樣品中的水分直接由冰態(tài)升華為氣態(tài)，樣品也不受表面張力的影響。但這種方法也有不足之處，如：樣品中的水分易形成冰晶而破壞超微結(jié)構(gòu)。因此需要大量的冷凍劑和較好的真空裝置，使造價提高。再加上所需冷凍時間過長，更限制了這種方法的使用。所以，盡管

16、用這種方法能較好地保存樣品中的水溶性和脂溶性 物質(zhì)，但是使用仍不普遍。有下面兩種方法： 一直接冷凍干燥法：這種方法適用于新鮮樣品。一直接冷凍干燥法：這種方法適用于新鮮樣品。把樣品粘附在小銅片上后快速投入丙烷中進行冷凍固定，丙烷須用液氮預(yù)冷。固定好的樣品放入真空噴鍍儀中，用液氮冷卻，保持一定的溫度壓力連續(xù)抽真空若干天，直至樣品完全干燥為止。l乙醇冷凍干燥法：乙醇冷凍干燥法： 按照常規(guī)方法戊二醛固定，乙醇梯度脫水至100%。把樣品投入注滿液氮的冷凍干燥儀的金屬杯中使樣品中的乙醇固化。把金屬杯放入冷凍干燥儀的噴度裝置中，通過旋轉(zhuǎn)泵抽氣使液氮固化并升華，接著固化的乙醇也升華，樣品隨之干燥。l大多數(shù)生物

17、樣品的表面電阻很高，直接用掃描電鏡觀察會產(chǎn)生充放電效應(yīng)，所以要對樣品進行導(dǎo)電處理。常用的導(dǎo)電處理方法有金屬噴鍍法和導(dǎo)電染色法金屬噴鍍法和導(dǎo)電染色法。l金屬噴鍍法金屬噴鍍法是將干燥后的樣品用導(dǎo)電膠粘在樣品臺上，放入真空噴鍍儀內(nèi)或離子濺射儀內(nèi)噴約15nm厚的碳或金，隨后進行電鏡觀察。這種方法除可消除充放電效應(yīng)外，還可提高二次電子發(fā)射率。缺點是熱輻射和原子轟擊會使樣品變形。l導(dǎo)電染色法導(dǎo)電染色法是用金屬鹽類化合物與生物體的蛋白質(zhì)、脂類、糖類等結(jié)合，使表面離子化，或游離出金屬分子鑲嵌于生物分子間，從而使樣品表面電阻值降低，消除充電放電效應(yīng)，同時在一定程度上起硬化組織的固定作用。l金屬鍍膜法就是把樣品鍍

18、上一層很薄的并且非常均勻的金屬膜（一般20nm厚的金膜）。因為金的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，不與樣品中的化學(xué)成分反應(yīng)，使既不影響樣品本身的結(jié)構(gòu)，樣品又有導(dǎo)電性。經(jīng)過金屬鍍膜的樣品，能產(chǎn)生大量的二次電子從而提高圖像的而質(zhì)量。另外還能加強樣品對電子束轟擊的抗擊力，以減小電子束對樣品的損傷。l有兩種方法，一是離子濺射法，二是真空噴度法。在電場的作用下，使真空罩內(nèi)殘留的氣體分子被電離為陽離子和電子，它們分別飛向陰極和陽極并不斷的與其它的氣體分子相碰撞，表現(xiàn)為紫色的放電現(xiàn)象。此外，陽離子又可以轟擊陰極上的金屬靶，使部分金屬原子被激發(fā)出來，這些金屬原子在電場的加速作用下，可從不同的方向和角度飛向陽極呈漫散射的方式

19、覆蓋在樣品的表面，形成連續(xù)而均勻的金屬膜。薄膜的厚度可以控制在1-100nm之間，這樣既不掩蓋樣品的表面結(jié)構(gòu)，又使樣品具有了良好的導(dǎo)電性。6.3.1.1離子濺射法原理離子濺射法原理1.因為飛散出來的金屬顆粒為原子或分子很小，所以鍍膜質(zhì)地精細(xì)。2. 因為金屬顆粒帶負(fù)電，樣品表面帶正電，且各部位的正電位相同，使金屬顆粒均勻的飛向帶正電的樣品表面，所以鍍膜均勻。3. 鍍膜儀通過調(diào)節(jié)電流強度和真空度來控制飛散出來的金屬顆粒的數(shù)量，從而有效的控制鍍膜的厚度，使其既不遮蓋樣品表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)，又能具有良好的導(dǎo)電性。4. 離子濺射時原子的能量大約為真空鍍膜時原子能量的100倍，所以濺射鍍膜的附著力強。6.3.

20、1.2l在真空的條件下，把金屬絲加熱到一定的溫度時，該金屬就會急劇地蒸發(fā)。此時，如果把樣品放在距金屬絲5cm左右處，蒸發(fā)的金屬原子就會灑落在其表面，使其覆蓋上一層金屬膜，真空鍍膜儀就是根據(jù)這一原理設(shè)計的。l由于鍍膜是在真空條件下進行的，因此即可以防止樣品受傳導(dǎo)和對流引起的熱損傷，又可以防止樣品受金屬氧化引起的污染。l并且在鍍膜的時候樣品臺旋轉(zhuǎn)使樣品表面的鍍膜均勻。l一般用鋁和銅，比離子濺射法成本低。l對于樣品表面凹凸明顯的，最好先噴一層碳以加固其表面結(jié)構(gòu)，而離子濺射法不能噴碳，所以對于這類有特殊要求的樣品選用真空鍍膜儀。l離子濺射鍍膜與真空鍍膜相比，其主要優(yōu)點是：l（ 1 ）裝置結(jié)構(gòu)簡單，使用

21、方便，濺射一次只需幾分鐘，而真空鍍膜則要半個小時以上。（ 2 ）消耗貴金屬少，每次僅約幾毫克。（ 3 ）對同一種鍍膜材料，離子濺射鍍膜質(zhì)量好，能形成顆粒更細(xì)、更致密、更均勻、附著力更強的膜。l對不導(dǎo)電的樣品，最好在樣品加工完畢后，立即蒸鍍金或者碳等導(dǎo)電膜，鍍膜后應(yīng)馬上分析，避免表面污染和導(dǎo)電膜脫落。l金導(dǎo)電膜導(dǎo)電性好，二次電子發(fā)射率高，可以拍攝出質(zhì)量好的圖象。如果成分定性、定量分析，必須蒸鍍碳導(dǎo)電膜。碳為超輕元素，對所分析元素的X 射線吸收小，對定量分析結(jié)果影響小。蒸鍍金可以用真空鍍膜儀或離子濺射儀，蒸鍍碳只能用真空鍍膜儀。鍍膜要均勻，厚度控制在20nm 左右，為了保證樣品與標(biāo)樣鍍膜厚度相同，

22、標(biāo)樣和樣品應(yīng)該同時蒸鍍。l真空鍍膜儀在蒸鍍過程中會產(chǎn)生1000C2000C 的高溫，而樣品距蒸發(fā)源約為15mm 左右，對熔點低的有機物樣品、生物樣品及鑲嵌材料等都會產(chǎn)生影響。必須控制蒸鍍時間，長時間鍍膜不但溫升影響樣品，而且鍍膜厚度增加會影響定量分析結(jié)果。如果金膜太厚，金粒子會聚集成島狀結(jié)構(gòu)，在高倍圖象觀察時產(chǎn)生假象，同時也會覆蓋樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。為了控制鍍碳膜厚度，最簡單的方法是在鍍膜樣品的附近放一塊經(jīng)拋光的黃銅，用黃銅表面鍍膜后的干涉色判斷膜厚，20nm黃銅表面的干涉色為藍(lán)紫色。比較項目離子濺射法真空鍍膜法要求真空度低（0.01-0.1乇）高（0.5乇）鍍膜材料金、鉑金銀銅鋁碳能否噴碳膜不能

23、能鍍膜附著力強弱控制鍍膜厚度容易較難二次電子獲取量較多一般樣品損傷程度較大樣品污染黑化污染一般無 導(dǎo)電染色法是一種將極細(xì)小的金屬顆粒植入生物樣品中，以增強樣品導(dǎo)電性的染色過程。它要求染液既不污染樣品，又能完好保存組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)，并且使樣品有良好的導(dǎo)電性。經(jīng)導(dǎo)電染色的樣品在掃描電鏡下能釋放較多的二次電子從而加強圖像的亮度和反差。特別是對于一些需要進行血管灌流或穿刺灌流的動物組織樣品，如：心臟、氣管、腸管胃等，最好進行導(dǎo)電染色，使在清洗樣品的同時，又能提高樣品的導(dǎo)電性能。 常用的導(dǎo)電染液由緩沖液/固定液配制而成，同時具有固定作用。l單寧酸/鋨酸： 基于特殊的分子結(jié)構(gòu)，單寧酸對酸性和中性溶液中的蛋白

24、質(zhì)具沉淀作用，對一些金屬酸或金屬鹽類具有還原作用。特別是單寧酸/鋨酸同時存在的情況下，單寧酸和鋨酸結(jié)合，形成單寧酸鋨酸復(fù)合物，使單寧酸/鋨酸混合液除了具有固定作用之外，又能將金屬顆粒植入生物樣品中。但需要注意的是，用單寧酸/鋨酸處理樣品之后，一定要徹底清洗，以防止污染。 一般用0.1mol/l的磷酸緩沖液或二甲胂酸鈉緩沖液配制單寧酸/鋨酸導(dǎo)電染液，單寧酸的濃度燥0.5-4之間，鋨酸的濃度燥0.1-1之間，可以根據(jù)樣品的需要進行選擇。為防止為例污染新配制的單寧酸溶液，最好在過濾后使用。染色時間根據(jù)樣品的大小來確定，對于3mm3左右的組織塊，須用導(dǎo)電液在室溫下或4攝氏度下處理1-2h，而單細(xì)胞只處

25、理10-30分鐘就可以了。經(jīng)過導(dǎo)電染色處理的樣品，可以省略金屬鍍膜。有人對導(dǎo)電染色后的樣品進行鍍膜和不鍍膜的比較觀察，發(fā)現(xiàn)圖像在亮度和反差方面沒有明顯的區(qū)別。l鋨酸：常用1OsO4/緩沖液作為后固定液，一般4攝氏度下處理10分鐘至1h。因為鋨酸含金屬鋨顆粒，對生物樣品中的某些蛋白質(zhì)有親和性，所以在固定樣品的同時，向樣品中植入了金屬顆粒，因而增強了樣品的導(dǎo)電性。鋨酸對組織的滲透性不強，與戊二醛的前固定相比較，往往需要更長的時間，但鋨酸處理的時間過長，又會腐蝕破壞生物樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)，使之產(chǎn)生空洞。所以要根據(jù)樣品的具體情況，靈活掌握用鋨酸處理的時間。一.直接觀察法：這種方法比較簡單、快捷，對樣品的損

26、傷較少，雖然在分辨力上受一定的限制，但也比較常用。下面介紹兩種直接觀察法。1.固體樣品的直接觀察法：對于含水少，本身就比較干燥且有有定導(dǎo)電能力的固體樣品，如：骨骼、牙齒、礦石、土壤、干果、竹木以及植物的干標(biāo)本等，可以直接用導(dǎo)電雙面膠帶將樣品粘到樣品臺上，省略噴涂就可以用掃描電鏡觀察。但要注意以下幾點：（1）樣品的底面應(yīng)盡量平整，以擴大與樣品臺的接觸面，改善導(dǎo)電狀況。如果需要，可在粘樣品之前適當(dāng)修整樣品的底面。（2）用這種方法的圖像分辨力不高，在調(diào)試儀器時應(yīng)選擇較低的加速電壓（約5KV），并且放大倍數(shù)為幾百倍為宜。（3）如果圖像的質(zhì)量不行，可以適當(dāng)進行導(dǎo)電噴涂。l2.活體樣品的直接觀察法：對于一

27、些體積小，且含水少的活的昆蟲等樣品，如：蚊子、螞蟻、螨蟲、蛾等，也可以省略化學(xué)固定等一系列步驟，使之在生活狀態(tài)下就可以在掃描電鏡下觀察，具體步驟如下：l（1）取樣：注意不要碰傷樣品。l（2）清洗：用生理鹽水或PBS洗1-3次。注意不要致死樣品，清洗液的pH值與樣品本身的一致。如果樣品干凈可以不清洗。l（3）粘樣：用導(dǎo)電膠帶將樣品粘在樣品臺上，注意既要粘牢，防止樣品脫落阻塞通道，又要使樣品能輕微運動。l（4）觀察：一般用低電壓（2-5kV）。注意操作要熟練，迅速抓住時機在20分鐘之內(nèi)拍照完畢。因為在真空狀態(tài)下，活體樣品內(nèi)的水分易蒸發(fā)，從而導(dǎo)致樣品收縮變形甚至死亡。有的掃描電鏡配有高速攝影和錄相裝

28、置，可以獲取樣品的動態(tài)變化圖像，如：細(xì)胞分裂的全過程等。二、游離細(xì)胞的觀察法 用掃描電鏡觀察游離細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)已相當(dāng)普遍，樣品制備的關(guān)鍵是如何把樣品粘在樣品臺上，具體方法很多。1.濾紙吸附法：用1戊二醛/緩沖液固定，1000r/m 離心10分鐘，去上清液。將細(xì)胞的濃懸液滴在一小片濾紙上，系列乙醇脫水，臨界點干燥，噴涂后觀察。這種方法簡便易行，但圖像容易混雜濾紙的顯微。2.金屬片法：與第一種方法類似，只是改為將細(xì)胞 濃懸液滴在有微孔的金屬片上，再進行一系列操作。3.玻璃片法：現(xiàn)在蓋玻片上鍍一層金屬膜以減少放電現(xiàn)象，改善觀察效果。再把濃細(xì)胞懸液（此時已經(jīng)過每步離心脫水到100）滴到玻片上，接著進行

29、干燥。或把蓋玻片浸入0.3-0.5孚爾瓦/氯仿液中，約10s后取出，自然干燥，使玻片上均勻地涂上一層膜，容易吸附細(xì)胞，再按照前法操作。1.取材：取材準(zhǔn)確、體積不宜過大，以減少不必要的觀察量。2.固定：一般雙固定，即戊二醛前固定，鋨酸后固定。3.清洗：生理鹽水或緩沖液4.系列乙醇脫水和醋酸異戊酯置換5. 干燥：臨界點干燥、空氣干燥、冷凍干燥等6.導(dǎo)電處理：離子濺射或真空噴鍍l為了擴大掃描電鏡的應(yīng)用范圍，越來越多的研究工作者采用不同的方法，用掃描電鏡揭示組織塊和細(xì)胞等樣品斷裂面的超微結(jié)構(gòu)，得到的圖像立體感強更加逼真，并且可與透射電鏡的觀察效果互補長短。液氮冷凍割斷法：l1.一般方法：lA冷凍：把已

30、干燥好的樣品浸入液氮，或放在已經(jīng)用液氮制冷的金屬塊上冷凍。lB割斷：用雙面刀片把樣品切成兩塊。lC噴涂：把樣品粘在樣品臺上，注意斷裂面朝上，再真空噴金。l2.使用掃描電鏡冷凍切割裝置l附設(shè)在掃描電鏡上的冷凍割斷裝置由冷凍劑罐、冷刀裝置、預(yù)冷真空控制裝置、樣品臺調(diào)節(jié)裝置、溫度控制裝置和觀察窗等組成。用這種裝置，可連續(xù)地進行樣品的冷凍、割斷、噴涂和觀察等一系列操作。程序如下：lA冷凍：將樣品安放在一個金屬臺支架上，用樣品攜帶桿固定好后，迅速放入液氮冷凍（使用樣品攜帶桿可以減少樣品表面的結(jié)霜）lB斷裂：用樣品攜帶桿把預(yù)冷的樣品送入掃描電鏡的冷凍割斷小室中，用到斷裂樣品。（小室與冷凍劑罐相連，使樣品臺

31、和刀都制冷）lC噴涂：通過調(diào)節(jié)加熱控制裝置，使樣品的斷裂面升華，接著用噴金裝置噴涂，這一步可以提高樣品的導(dǎo)電性和圖像的反差。lD觀察：接著將樣品送入掃描電鏡的樣品室，就可以觀察了。3. 樹脂冷凍割斷法這種方法容易掌握，應(yīng)用也比較廣泛?？蛇x用多種樹脂，如：EPON812等。在操作過程中共同的問題是，既要防止樹脂聚合，又要使樹脂固化，所以采用冷凍方法處理樣品。具體步驟如下:A修樣：取新鮮組織，切成1mm*1mm*5mm的棒狀。B固定和脫水:常規(guī)方法C置換：將樣品浸入氧化丙烷30min，在換氧化丙烷/樹脂混合液浸數(shù)小時。D包埋：醫(yī)用2號膠囊中注滿樹脂（注意不含加速劑），在放入樣品，9-12h。E固化

32、：80度下固化，可用液氮或乙醚/干冰等冷凍劑。F割斷：用刀具等在木板態(tài)上槌打 。槌打時用力要適當(dāng)，使斷面平整 光潔猶如玻璃為佳。G脫樹脂：將割斷的樣品浸入氧化丙烯中處理2h，其間換3-5次新鮮的氧化丙烯，以徹底洗去樣品中的樹脂。H按照常規(guī)方法臨界點干燥和噴涂。l1.苯乙烯樹脂割斷法：l這種方法的特點是操作簡單，一方面包埋樹脂要完全聚合，所以樣品可保存較長時間；另一方面樣品易被斷裂，包埋的樹脂也好溶解，所以應(yīng)用比較廣泛。特別對于較微小的樣品，方向性較強的樣品和用其它方法不易斷裂的較硬的樣品，如：結(jié)締組織、軟骨等更加適宜。具體步驟如下：（1）修整樣品，常規(guī)方法固定、脫水。（2）置換：將樣品浸入1：

33、1乙醇/苯乙烯單體混合液中30min，在于-4度下用苯乙烯單體處理約12h。（3）包埋：向苯乙烯單體中加入2-3%的過氧化苯乙酰，充分?jǐn)嚢杈鶆蛑螅⑷?以放有樣品的醫(yī)用膠囊中，隨機蓋好。（4）聚合：60度，24h以上。（5）割斷：先剝?nèi)ツz囊，在用割斷器操作。（6）脫樹脂：將割斷的帶有樹脂的樣品投入氧化丙烯中，約2h，期間換3-4次氧化丙烯。（7）置換和干燥：用乙酸異戊酯處理20min以上，臨界點干燥游離細(xì)胞割斷法：（1）固定：采用低濃度短時間的固定較好。如：1戊二醛/0.1mol/l磷酸緩沖液，10-30min。（2）離心：1000g，10min，離心成團，去上清液。（3）加固：按體積1：1

34、加入蛋清，攪拌均勻，使之成為蛋白/細(xì)胞混合液。（4）后固定：用滴管緩緩加入戊二醛固定液，固定2h以上，直到蛋白從表面到底部都變硬，期間可換幾次新鮮的固定液。（5）修整：取出蛋白/細(xì)胞混合塊，用雙面刀片切成小條。（6）割斷：可選任意一種方法，操作同組織塊一樣。l超高壓電鏡電子束的波長更短，速度更快，穿透力比普通透射電鏡要強得多。對于較厚的生物樣品，亦能穿透，并且既能增加圖像的立體感，又不影響圖像的分辨力，所以可用超高壓電鏡觀察比較厚的樣品。但由于透射電鏡的場深比較大，較厚的樣品中各層次都會在焦使圖像包含的內(nèi)容過多，最終影響圖像分析的質(zhì)量。所以，超高壓電鏡在生物領(lǐng)域應(yīng)用不十分廣泛。只作簡單介紹。l

35、一、制備厚切片的原則 厚切片指1.5-3微米的厚切片。制備厚切片的過程與普通超薄切片相似，只是在某些步驟有一些特殊的要求。第一，樣品塊相對要軟一些，以便連續(xù)切片和保護刀口；第二，要用較厚的支持膜，并噴碳加固，以防電子束的轟擊；第三，可選用折疊式的單縫載網(wǎng)，以防止切片從載網(wǎng)上脫落；第四，最好用浸沒法染色，且染色的時間可適當(dāng)延長，以便使染液浸透樣品。此外，在包埋之前進行塊染，亦能加強染色的效果。在這些基本原則的指導(dǎo)下，可以根據(jù)具體條件選用可行的辦法。1.取材與固定；與超薄切片近似，用25多聚甲醛或戊二醛在室溫下固定1-3h，1鋨酸后固定 30min1h。2.塊染（需要時加用）：用醋酸雙氧鈾/乙醇飽

36、和溶液或2磷鎢酸/乙醇溶液，在室溫下浸沒樣品塊1-2h，可增加圖像的反差。3.脫水：用系列梯度乙醇或丙酮脫水。4.包埋與聚合：用812，這種包埋劑聚合后較軟，又有一定的韌性。為了加強染色效果，可用5醋酸雙氧鈾/75乙醇溶液，在60度下浸泡聚合好的包埋塊，24-36h。5.準(zhǔn)備載網(wǎng)：（1）載網(wǎng)的選擇：因為厚切片不易粘牢，所以可選用折疊式載網(wǎng)。這種載網(wǎng)可把切片夾住以防脫落。但是這種載網(wǎng)不易覆蓋支持膜，電鏡觀察時切片在電子束轟擊下容易漂移或開裂。解決的辦法之一是用普通單縫載網(wǎng)，并覆蓋較厚的孚爾瓦/碳膜。另外，在電鏡操作的時候，注意電子束斑的調(diào)節(jié)要得當(dāng)，防止過亮。（2）載網(wǎng)的清洗：為了把樣品粘牢和防止

37、污染，一定要徹底清洗載網(wǎng)，尤其是舊網(wǎng)。具體辦法是：先把載網(wǎng)浸入去污劑中，用超聲波清洗；再用重蒸水沖洗；接著用100丙酮沖洗。最后，為解決撈片難的問題，還可以對載網(wǎng)進行輝光放電處理。（3）制備支持膜：與制備超薄切片中的相似，但需制備較厚的支持膜，改用0.8孚爾瓦/二氯乙烯溶液，并真空噴鍍20-60nm厚的碳膜。6.切片與撈片：程序與超薄切片相似，只是調(diào)解切片的厚度和切速有所不同。用切片的干涉色來判斷切片的厚度，紫色以上為宜。撈片時注意，如果用單縫載網(wǎng)撈連續(xù)切片，一定要對正，使切片局域單縫中，否則就觀察不到了。另外，如果載網(wǎng)經(jīng)一系列清洗后仍有靜電排斥切片，不易撈取和粘牢，可以先在1異丁烯/二甲苯溶

38、液中浸一下，在進行撈片。7.電子染色：用浸泡染色法，使厚切片的上下兩面都能浸透染液，可加強染色效果。并適當(dāng)延長染色時間，用飽和醋酸雙氧鈾染1-2h，用檸檬酸鉛染30-60min。l整裝樣品是指經(jīng)過一系列處理后，直到電鏡觀察，始終保持完整狀態(tài)的樣品。即：不經(jīng)過切片和斷裂等破壞性處理的樣品。用超高壓電鏡觀察的整裝生物樣品多是完整的細(xì)胞或細(xì)菌等。因它們的直徑已足夠小，超高壓電鏡可以穿透，不必切片亦能進行觀察。下面以整裝細(xì)胞的樣品制備為例，介紹具體方法。l一、準(zhǔn)備工作1.載網(wǎng)的準(zhǔn)備：載網(wǎng)上覆蓋孚爾瓦膜并噴碳膜加固，紫外線照射滅菌。2.培養(yǎng)細(xì)胞：把載網(wǎng)的膜面朝上，浸沒載培養(yǎng)液中，并接種培養(yǎng)的細(xì)胞，載37

39、度溫箱中培養(yǎng)3-4天，注意無菌操作。二、電鏡樣品制備程序1.清洗：用吸管緩緩吸掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，載注入緩沖液靜置5min以洗去細(xì)胞表面多于的培養(yǎng)液。2.前固定：先洗去緩沖液，載注入戊二醛 在室溫下固定20-30min。3.清洗：同1.4.鋨酸后固定。5.清洗6.脫水:系列乙醇梯度脫水。8.臨界點干燥。9.電鏡觀察。l在從事電鏡是工作中學(xué)會觀察也是很重要的。首先，要有正確的態(tài)度和方法，既要洞察每一個細(xì)節(jié)，又要抓住每一個主要目標(biāo)，還要善于分析，區(qū)分真?zhèn)?。另外，觀察之前還需要了解和掌握定的有關(guān)超微結(jié)構(gòu)方面的基本知識和電鏡拍照的方法。l一、樹立全局的和立體的觀點l電鏡樣品很小，如：超薄切片的載網(wǎng)直徑只有3mm，掃描電鏡的你股票雖然大些但也不過幾個厘米。因此，對于