離心分光技術(shù)最后有圖

1、5 離心技術(shù) 離心技術(shù)在生物科學(xué)，特別是在生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，已得到十分廣泛的應(yīng)用，每個(gè)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都要裝備多種型式的離心機(jī)。離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。5.1 基本原理 當(dāng)一個(gè)粒子（生物大分子或細(xì)胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時(shí)，此離心力“F”由下式定義，即： F = m·a = m·2 r a 粒子旋轉(zhuǎn)的加速度， m 沉降粒子的有效質(zhì)量，粒子旋轉(zhuǎn)的角速度， r

2、粒子的旋轉(zhuǎn)半徑( cm )。 通常離心力常用地球引力的倍數(shù)來(lái)表示，因而稱(chēng)為相對(duì)離心力 “ RCF ”?；蛘哂脭?shù)字乘“g”來(lái)表示，例如25000×g，則表示相對(duì)離心力為25000。相對(duì)離心力是指在離心場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”（980cm/sec2），此時(shí)“RCF”相對(duì)離心力可用下式計(jì)算： RCF = 1.119×105×(rpm)2 r ( rpm revolutions per minute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min ) 由上式可見(jiàn)，只要給出旋轉(zhuǎn)半徑r，則RCF和rpm之間可以相互換算。但是由于轉(zhuǎn)頭的形狀及結(jié)構(gòu)的差異，使每臺(tái)

3、離心機(jī)的離心管，從管口至管底的各點(diǎn)與旋轉(zhuǎn)軸之間的距離是不一樣的，所以在計(jì)算是規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半徑“ra v”代替： ra v=( r minrmax) / 2 r的測(cè)量如下圖所示： 34º rmin 旋轉(zhuǎn)軸 rav rmax 一般情況下，低速離心時(shí)常以轉(zhuǎn)速“rpm”來(lái)表示，高速離心時(shí)則以“g” 表示。計(jì)算顆粒的相對(duì)離心力時(shí)，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)軸中心的距離“r”不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。因此在報(bào)告超離心條件時(shí)，通?？偸怯玫匦囊Φ谋稊?shù)“×g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“rpm”，因?yàn)樗梢哉鎸?shí)地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動(dòng)態(tài)變化?？萍嘉墨I(xiàn)

4、中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值（RCFa v），即離心管中點(diǎn)的離心力。 為便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間的換算，Dole 和Cotzias 利用RCF的計(jì)算公式，制作了轉(zhuǎn)速“rpm”、相對(duì)離心力“RCF”和旋轉(zhuǎn)半徑“r”三者關(guān)系的列線圖，圖式法比公式計(jì)算法方便（列線圖參見(jiàn)附錄）。換算時(shí)，先在r標(biāo)尺上取已知的半徑和在rpm標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，與圖中RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)即為相應(yīng)的相對(duì)離心力數(shù)值。注意，若已知的轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺的右邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺右邊的數(shù)值，轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺左邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺左邊的數(shù)值。5.2 離心機(jī)的主要構(gòu)造和類(lèi)型 離心機(jī)可分為工業(yè)

5、用離心機(jī)和實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)又分為制備性離心機(jī)和分析性離心機(jī)，制備性離心機(jī)主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大，分析性離心機(jī)一般都帶有光學(xué)系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測(cè)物質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為（用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)），能推斷物質(zhì)的純度、形狀和分子量等。分析性離心機(jī)都是超速離心機(jī)。 1. 制備性離心機(jī)可分為三類(lèi)： 普通離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速6000 rpm左右，最大相對(duì)離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離，轉(zhuǎn)子有角式和外擺式，其轉(zhuǎn)速不能?chē)?yán)格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅

6、血球、酵母細(xì)胞等。這種離心機(jī)多用交流整流子電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)，電機(jī)的碳刷易磨損，轉(zhuǎn)速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié)，起動(dòng)電流大，速度升降不均勻，一般轉(zhuǎn)頭是置于一個(gè)硬質(zhì)鋼軸上，因此精確地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要，否則會(huì)損壞離心機(jī)。 高速冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為2000025000rpm（r/min），最大相對(duì)離心力為89000×g，最大容量可達(dá)3升，分離形式也是固液沉降分離，轉(zhuǎn)頭配有各種角式轉(zhuǎn)頭、蕩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和大容量連續(xù)流動(dòng)式轉(zhuǎn)頭、一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在040C，轉(zhuǎn)速、溫度和時(shí)間都可以嚴(yán)格準(zhǔn)確地控制，并有指針或數(shù)字顯

7、示，通常用于微生物菌體、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞器、硫銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細(xì)胞器(如核蛋白體)或單個(gè)分子。 超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)5000080000 rpm，相對(duì)離心力最大可達(dá)510000×g，最著名的生產(chǎn)廠商有美國(guó)的貝克曼公司和日本的日立公司等，離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機(jī)的出現(xiàn)，使生物科學(xué)的研究領(lǐng)域有了新的擴(kuò)展，它能使過(guò)去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細(xì)胞器得到分級(jí)分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。超速離心機(jī)主要由驅(qū)動(dòng)和速度控制、溫度控制、真空系統(tǒng)和轉(zhuǎn)頭四

8、部分組成。超速離心機(jī)的驅(qū)動(dòng)裝置是由水冷或風(fēng)冷電動(dòng)機(jī)通過(guò)精密齒輪箱或皮帶變速，或直接用變頻感應(yīng)電機(jī)驅(qū)動(dòng)，并由微機(jī)進(jìn)行控制，由于驅(qū)動(dòng)軸的直徑較細(xì)，因而在旋轉(zhuǎn)時(shí)此細(xì)軸可有一定的彈性彎曲，以適應(yīng)轉(zhuǎn)頭輕度的不平衡，而不致于引起震動(dòng)或轉(zhuǎn)軸損傷，除速度控制系統(tǒng)外，還有一個(gè)過(guò)速保護(hù)系統(tǒng)，以防止轉(zhuǎn)速超過(guò)轉(zhuǎn)頭最大規(guī)定轉(zhuǎn)速而引起轉(zhuǎn)頭的撕裂或爆炸，為此，離心腔用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。溫度控制是由安裝在轉(zhuǎn)頭下面的紅外線射量感受器直接并連續(xù)監(jiān)測(cè)離心腔的溫度，以保證更準(zhǔn)確更靈敏的溫度調(diào)控，這種紅外線溫控比高速離心機(jī)的熱電偶控制裝置更敏感，更準(zhǔn)確。超速離心機(jī)裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機(jī)的主要區(qū)別。離心機(jī)的速度在2

9、000 rpm以下時(shí)，空氣與旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭之間的磨擦只產(chǎn)生少量的熱，速度超過(guò)20000 rpm時(shí)，由磨擦產(chǎn)生的熱量顯著增大，當(dāng)速度在40000 rpm以上時(shí)，由磨擦產(chǎn)生的熱量就成為嚴(yán)重問(wèn)題，為此，將離心腔密封，并由機(jī)械泵和擴(kuò)散泵串聯(lián)工作的真空泵系統(tǒng)抽成真空，溫度的變化容易控制，磨擦力很小，這樣才能達(dá)到所需的超高轉(zhuǎn)速。2. 轉(zhuǎn)頭： 角式轉(zhuǎn)頭：角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有412個(gè)裝離心管用的機(jī)制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在2040度之間，角度越大沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好。這種轉(zhuǎn)頭的優(yōu)點(diǎn)是具有較大的容量，且重心低，運(yùn)轉(zhuǎn)平衡，壽命較長(zhǎng)，

10、顆粒在沉降時(shí)先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱(chēng)為“壁效應(yīng)”，壁效應(yīng)容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的對(duì)流擾亂，影響分離效果。 蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個(gè)自由活動(dòng)的吊桶（離心套管）構(gòu)成。當(dāng)轉(zhuǎn)頭靜止時(shí)，吊桶垂直懸掛，當(dāng)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達(dá)到每分鐘200到800轉(zhuǎn)時(shí)，吊桶蕩至水平位置，這種轉(zhuǎn)頭最適合做密度梯度區(qū)帶離心，其優(yōu)點(diǎn)是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，離心時(shí)被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，而不像角式轉(zhuǎn)頭中樣品沉淀物的界面與離心管成一定角度，因而有利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。其缺點(diǎn)是顆粒沉降距離長(zhǎng)，離心所需時(shí)間也長(zhǎng)。 區(qū)帶轉(zhuǎn)

11、頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無(wú)離心管，主要由一個(gè)轉(zhuǎn)子桶和可旋開(kāi)的頂蓋組成，轉(zhuǎn)子桶中裝有十字型隔板裝置，把桶內(nèi)分隔成四個(gè)或多個(gè)扇形小室，隔板內(nèi)有導(dǎo)管，梯度液或樣品液從轉(zhuǎn)頭中央的進(jìn)液管泵入，通過(guò)這些導(dǎo)管分布到轉(zhuǎn)子四周，轉(zhuǎn)頭內(nèi)的隔板可保持樣品帶和梯度介質(zhì)的穩(wěn)定。沉降的樣品顆粒在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中的沉降情況不同于角式和外擺式轉(zhuǎn)頭，在徑向的散射離心力作用下，顆粒的沉降距離不變，因此區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的“壁效應(yīng)”極小，可以避免區(qū)帶和沉降顆粒的紊亂，分離效果好，而且還有轉(zhuǎn)速高，容量大，回收梯度容易和不影響分辨率的優(yōu)點(diǎn)，使超離心用于制備和工業(yè)生產(chǎn)成為可能。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的缺點(diǎn)是樣品和介質(zhì)直接接觸轉(zhuǎn)頭，耐腐蝕要求高，操作復(fù)雜。 垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂

12、直放置，樣品顆粒的沉降距離最短，離心所需時(shí)間也短，適合用于密度梯度區(qū)帶離心，離心結(jié)束后液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向，因而降速要慢。 連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類(lèi)似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成，離心時(shí)樣品液由入口連續(xù)流入轉(zhuǎn)頭，在離心力作用下，懸浮顆粒沉降于轉(zhuǎn)子桶壁，上清液由出口流出。3. 離心管：離心管主要用塑料和不銹鋼制成，塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點(diǎn)是易變形，抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短。不銹鋼管強(qiáng)度大

13、，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時(shí)也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴(yán)，倒置不漏液。管蓋有三種作用：防止樣品外泄。用于有放射性或強(qiáng)腐蝕性的樣品時(shí)，這點(diǎn)尤其重要。防止樣品揮發(fā)。支持離心管，防止離心管變形。4. 分析性離心機(jī)：分析性離心機(jī)使用了特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過(guò)程。從而確定其物理性質(zhì)。分析性超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是橢圓形的，以避免應(yīng)力集中于孔處。此轉(zhuǎn)頭通過(guò)一個(gè)有柔性的軸聯(lián)接到一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置上，轉(zhuǎn)頭在一個(gè)冷凍的和真空的腔中旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)頭上有26個(gè)裝離心杯的小室，離心杯是扇形石英的，可以上下透光，離

14、心機(jī)中裝有一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，在整個(gè)離心期間都能通過(guò)紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測(cè)離心杯中沉降著的物質(zhì)，在預(yù)定的期間可以拍攝沉降物質(zhì)的照片，在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時(shí)，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照像底板上產(chǎn)生了一個(gè)“峰”，由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，因此峰也移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以計(jì)算出樣品顆粒的沉降速度。分析性超速離心機(jī)和主要特點(diǎn)就是能在短時(shí)間內(nèi)，用少量樣品就可以得到一些重要信息，能夠確定生物大分子是否存在，其大致的含量，計(jì)算生物大分子的沉降系數(shù)，結(jié)合界面擴(kuò)散，估計(jì)分子的大小，檢測(cè)分子的不均一性及混合物中各組份的比例，測(cè)定生物大分子的分子量，還可以檢測(cè)生物

15、大分子的構(gòu)象變化等。 5.3 制備性超速離心的分離方法：1. 差速沉降離心法： 這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時(shí)間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時(shí)間。當(dāng)以一定的離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開(kāi)。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過(guò)23

16、次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。此法主要由于組織勻漿液中分離細(xì)胞器和病毒，其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開(kāi)，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。2. 密度梯度區(qū)帶離心法（簡(jiǎn)稱(chēng)區(qū)帶離心法）：區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是：分離效果好，可一次獲得較純顆粒；適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；顆粒不會(huì)擠壓變形

17、，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。此法的缺點(diǎn)是：離心時(shí)間較長(zhǎng)；需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液；操作嚴(yán)格，不易掌握。密度梯度區(qū)帶離心法又可分為兩種：（1）差速區(qū)帶離心法：當(dāng)不同的顆粒間存在沉降速度差時(shí)（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱(chēng)為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20% 的沉降系數(shù)差或更少）或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)，與顆粒的密度無(wú)關(guān)，大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液

18、面上，離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開(kāi)原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開(kāi)，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達(dá)1.28 kg/cm3和60。此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間（2）等密度區(qū)帶離心法：離心管中預(yù)先放置好梯度介質(zhì)，樣品加在梯度液面上，或樣品預(yù)先與梯度介質(zhì)溶液混合后裝入離心管，通過(guò)離心形成梯度，這就是預(yù)形成梯度和離心形成梯度的等密度區(qū)帶離心產(chǎn)生梯度的二種方式。離心時(shí)，樣品的

19、不同顆粒向上浮起，一直移動(dòng)到與它們的密度相等的等密度點(diǎn)的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度離心法。體系到達(dá)平衡狀態(tài)后，再延長(zhǎng)離心時(shí)間和提高轉(zhuǎn)速已無(wú)意義，處于等密度點(diǎn)上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時(shí)間所影響，提高轉(zhuǎn)速可以縮短達(dá)到平衡的時(shí)間，離心所需時(shí)間以最小顆粒到達(dá)等密度點(diǎn)（即平衡點(diǎn)）的時(shí)間為基準(zhǔn)，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)日。等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無(wú)關(guān)，但大小和形狀決定著達(dá)到平衡的速度、時(shí)間和區(qū)帶寬度。等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl，其密度可達(dá)1.7 g/cm3。此法可分離核酸、亞細(xì)胞器等，也可以

20、分離復(fù)合蛋白質(zhì)，但簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)不適用。收集區(qū)帶的方法有許多種，例如：（1） 用注射器和滴管由離心管上部吸出。（2） 有針刺穿離心管底部滴出。（3） 用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。（4）用一根細(xì)管插入離心管底，泵入超過(guò)梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動(dòng)部分收集器收集。 5.4 離心操作的注意事項(xiàng)：高速與超速離心機(jī)是生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)和生化科研的重要精密設(shè)備，因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當(dāng)或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴(yán)重事故，因此使用離心機(jī)時(shí)都必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。1. 使用各種離心機(jī)時(shí)，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時(shí)重量之差不得超過(guò)各個(gè)

21、離心機(jī)說(shuō)明書(shū)上所規(guī)定的范圍，每個(gè)離心機(jī)不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中絕對(duì)不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時(shí)，管子必須互相對(duì)稱(chēng)地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周?chē)?. 裝載溶液時(shí)，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說(shuō)明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無(wú)蓋，液體不得裝得過(guò)多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿(mǎn)，以免離心時(shí)塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時(shí)清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保護(hù)的部件，搬動(dòng)時(shí)要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，要涂上一層上光臘

22、保護(hù)，嚴(yán)禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。3. 若要在低于室溫的溫度下離心時(shí)。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。4. 離心過(guò)程中不得隨意離開(kāi)，應(yīng)隨時(shí)觀察離心機(jī)上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應(yīng)立即停機(jī)檢查，及時(shí)排除故障。5. 每個(gè)轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時(shí)，使用轉(zhuǎn)頭時(shí)要查閱說(shuō)明書(shū)，不得過(guò)速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時(shí)間，若超過(guò)了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時(shí)，則須按規(guī)定降速使用。 6 分光光度技術(shù)6.1 基本原理利用紫外光、可見(jiàn)光、紅外光和激光等測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱(chēng)為分光光度法或分光光度技

23、術(shù)，使用的儀器稱(chēng)為分光光度計(jì)，這種分光光度計(jì)靈敏度高，測(cè)定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外/可見(jiàn)分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重點(diǎn)討論紫外/可見(jiàn)分光光度法的基本原理、儀器構(gòu)造及其在生化領(lǐng)域中的應(yīng)用等。1. 光譜：光是電磁波，可用波長(zhǎng)“”表示，電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續(xù)波長(zhǎng)的光譜所組成，對(duì)于生物化學(xué)來(lái)說(shuō)，最重要的波長(zhǎng)區(qū)域是可見(jiàn)光和紫外光。光的波長(zhǎng)是二個(gè)相鄰的波峰之間的距離。光的傳播是由相互垂直的電場(chǎng)分量“E”和磁場(chǎng)分量“H”所構(gòu)成。 C/波長(zhǎng) C光速 頻率，單位時(shí)間通過(guò)一個(gè)定點(diǎn)的波數(shù)。光又可以看作是由具有能量的粒子所組成。這些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：

24、Eh·H普朗克常數(shù)（ 6.624×10-27爾格·秒）頻率紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠(yuǎn)紫外）。由于吸收池（又稱(chēng)樣品池、比色杯等）和光學(xué)元件以及氧氣能吸收小于190nm波長(zhǎng)的光，因此常規(guī)紫外測(cè)定集中在近紫外區(qū)，即 200nm400nm?？梢?jiàn)光區(qū)為400nm800nm。組成物質(zhì)的分子均處于一定能態(tài)并不停地運(yùn)動(dòng)著，分子的運(yùn)動(dòng)可分為平動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)和分子內(nèi)電子的運(yùn)動(dòng)，每種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)都處于一定的能級(jí)，因此分子的能量可以寫(xiě)成：EE0+E平+E轉(zhuǎn)+E振+E電E0是分子內(nèi)在的不隨分子運(yùn)動(dòng)而改變的能量，平動(dòng)能E平只是溫度的函數(shù)，因此與光譜有關(guān)的能量變化是分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能量、振

25、動(dòng)能量和分子的電子能量。分子的每一種能量都有一系列的能級(jí)，能級(jí)不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子處于基態(tài)，當(dāng)它吸收一定能量躍遷到激發(fā)態(tài)，則產(chǎn)生吸收光譜。分子轉(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)和電子能級(jí)的躍遷，相應(yīng)地產(chǎn)生轉(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)及電子光譜。按照量子力學(xué)原理，分子能態(tài)按一定的規(guī)律跳躍式地變化，物質(zhì)在入射光的照射下，分子吸收光時(shí)，其能量的增加是不連續(xù)的，物質(zhì)只能吸收一定能量的光，吸收光的頻率和兩個(gè)能級(jí)間的能量差要符合下列關(guān)系：EE2- E1hE1、E2分別表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量，初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長(zhǎng)愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長(zhǎng)愈長(zhǎng)）。由于吸收是不連續(xù)的，因

26、此在光的一定部位出現(xiàn)一系列吸收暗帶。因?yàn)榉肿愚D(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)及電子能級(jí)躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現(xiàn)在不同的光譜區(qū)域。分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)級(jí)差小，E0.05電子伏特（ev），分子轉(zhuǎn)動(dòng)光譜的吸收出現(xiàn)在遠(yuǎn)紅外或微波區(qū)。振動(dòng)能級(jí)縱間的差別較大， E0.051.0 ev，振動(dòng)光譜出現(xiàn)在中紅外區(qū)。電子能級(jí)的級(jí)差更大， E120 ev，所以由電子躍遷得到的光譜出現(xiàn)在可見(jiàn)、紫外或波長(zhǎng)更短的光譜區(qū)。可見(jiàn)光、紫外光吸收光譜，是由于分子中聯(lián)系較松散的價(jià)電子被激發(fā)產(chǎn)生躍遷從而吸收光輻射能量形成的，即分子由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，電子由一個(gè)低能級(jí)的軌道（即成鍵軌道），吸收了光能量躍遷到高能級(jí)軌道（稱(chēng)為反鍵軌道）。與吸收光譜有

27、關(guān)的三種電子是： 二個(gè)原子的電子沿其對(duì)稱(chēng)方向相互形成的共價(jià)鍵（即單鍵），稱(chēng) 鍵， 構(gòu)成 鍵的電子稱(chēng) 電子，如CC、CH鍵。 平行于二個(gè)原子軌道形成的價(jià)鍵（即雙鍵），稱(chēng) 鍵，形成鍵的電子稱(chēng)為 電子，如C=C鍵。 未共享成鍵的電子，稱(chēng)n電子。各種電子躍遷所需能量大小的順序是：n* n*紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共軛雙鍵中的電子和未共享的電子對(duì)的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對(duì)紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分子的雙鍵數(shù)目和未共享電子對(duì)的共軛情況等。如下表所示： 電子躍遷類(lèi)型與紫外吸收波長(zhǎng)(nm)關(guān)系表電子躍遷類(lèi)型 例 子紫外吸收波長(zhǎng)范圍* CH 100150 nm *( 非共軛 ) CO 20

28、0 nm *( 共軛 ) CC 200300 nm n* CO 300 nm *躍遷：此類(lèi)躍遷所需能量較小，吸收波長(zhǎng)在紫外區(qū)的200300 nm，不飽和烴、共軛烯烴及芳香烴均可發(fā)生這類(lèi)躍遷，氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸均含有大量共軛雙鍵，因而200300 nm的紫外吸收測(cè)定，在生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)中有極廣泛的用途。若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長(zhǎng)，并測(cè)定物質(zhì)對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波長(zhǎng)作橫坐標(biāo)，“A”或“T”為縱座標(biāo)，畫(huà)出連續(xù)的“A”或“T”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。吸光度 A D C B max min 波長(zhǎng)(nm) 由上圖可以看出吸收光

29、譜的特征：曲線上“A”處稱(chēng)最大吸收峰，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱(chēng)最大吸收波長(zhǎng)，以max表示。曲線上“B”處有一谷，稱(chēng)最小吸收，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，稱(chēng)最小吸收波長(zhǎng)，以min 表示。曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱(chēng)肩峰。在吸收曲線的波長(zhǎng)最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當(dāng)強(qiáng)，但不成峰形，此處稱(chēng)為末端吸收。max是化合物中電子能級(jí)躍遷時(shí)吸收的特征波長(zhǎng)，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對(duì)鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，max、min、肩峰以及整個(gè)吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。測(cè)定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜圖相對(duì)照，對(duì)照時(shí)

30、須注意測(cè)定的條件，如溶劑、濃度等。常用標(biāo)準(zhǔn)的紫處吸收光譜是薩德勒研究實(shí)驗(yàn)公司編制的“Sadtler”紫外標(biāo)準(zhǔn)圖譜集，到七十年代末為止已收集28585個(gè)化合物紫外光譜圖，此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜是許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進(jìn)行化合物定性鑒定時(shí)，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團(tuán)或基團(tuán)，因此在鑒定時(shí)應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。由于電子躍遷的同時(shí)也引起分子的轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)光譜，要把電子躍遷和分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)的躍遷完全分開(kāi)是不可能的，因此我們常見(jiàn)的紫外吸收光譜是

31、由一個(gè)或幾個(gè)寬的吸收譜帶所組成。紫外光譜中常用的術(shù)語(yǔ)有發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。發(fā)色團(tuán)：凡是與飽和碳?xì)浠衔镞B接能引起n*、*、 n* 等電子躍遷的基團(tuán)稱(chēng)為發(fā)色團(tuán)。例如：CC、CO等發(fā)色團(tuán)。助色團(tuán)：助色團(tuán)是一些具有非共價(jià)鍵的基團(tuán)（如OH、NH2、SH等）。這些基團(tuán)在波長(zhǎng)200 nm處沒(méi)有吸收，當(dāng)它與發(fā)色團(tuán)相連接時(shí)，使發(fā)色團(tuán)的吸收帶向長(zhǎng)波移動(dòng)，稱(chēng)為紅移（或淺色效應(yīng)），紅移的同時(shí)吸收帶的強(qiáng)度增加。若助色團(tuán)與發(fā)色團(tuán)相連接，產(chǎn)生 n* 躍遷，使吸收波長(zhǎng)向短波移動(dòng)，稱(chēng)為蘭移（或深色效應(yīng)）。增色效應(yīng)（hyperchromic effect）:核酸變性或降解，使得DNA或RNA溶液對(duì)紫外光的吸收明

32、顯增加，即 值（吸光系數(shù)或稱(chēng)消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱(chēng)為增色效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在260nm處測(cè)量。減色效應(yīng)（hypochromic effect）:在一定的條件下，變性的核酸又可以復(fù)性，此時(shí)值又明顯減少，回復(fù)到原來(lái)的核酸分子值較低的水平，即此時(shí)DNA或RNA溶液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱(chēng)為減色效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在260nm條件下測(cè)量。2. 光吸收定律：朗伯比爾（Lambertbeer）光吸收定律： AlgTb cA吸光度，又稱(chēng)光密度“O.D”。T透光度， TI / I。， I。為照射到吸收池上的光強(qiáng)，I為透過(guò)吸

33、收池的光強(qiáng)。摩爾吸光系數(shù)或克分子吸光系數(shù)（L·mol1·cm1）。b樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。C樣品濃度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。摩爾吸光系數(shù)： ， 是物質(zhì)對(duì)某波長(zhǎng)的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越強(qiáng)，相應(yīng)的分光度法測(cè)定的靈敏度就越高。值越大，說(shuō)明電子躍遷的幾率大，通常 10105：一般認(rèn)為 104為強(qiáng)吸收；103104 為較強(qiáng)吸收； 102 為弱吸收，此時(shí)分光光度法不靈敏。因?yàn)橥ǔＪ褂梅止夤舛扔?jì)可檢測(cè)出的最小吸光度A0.001, 所以，當(dāng)b1cm, 105時(shí)，可檢測(cè)的溶液

34、最小濃度是C10-8 mol/L。常用的吸光系數(shù)還有一種百分吸光系數(shù)，即在某一波長(zhǎng)下，溶液濃度為1%（W / V），液層厚度b1cm時(shí)的吸光度，以E1%max表示。C百分濃度（W / V）。L液層厚度，吸收杯光徑長(zhǎng)度。 A吸光度。最大吸收波長(zhǎng)max時(shí)的 和E1%max值可用下式換算： E1%max×分子量 / 10吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性：A1C1b12C2b23C3b3即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長(zhǎng)下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例如，離子交換柱層析分離核

35、苷酸實(shí)驗(yàn)中可利用吸光度計(jì)算回收率：mC·V ， ， m溶質(zhì)的量 C溶質(zhì)濃度V溶液體積 A吸光度吸光系數(shù) b吸收池光徑 回收率（100%） （上式中假設(shè)總和各核苷酸的近似相等）例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測(cè)定 260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測(cè)定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計(jì)算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù) = 8.2×103 M1cm1（Mmol / L）。 A bC A（溶劑加樣品的吸光度）（溶劑的吸光度） A0.6500.0700.580 b1cm C=7.1×105 mol / L 例二：1%（W/V，10 mg / ml

36、）酪氨酸酶溶液的吸光度為24.9（1cm吸收池，280nm），計(jì)算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的濃度。由于這兩種酶溶液的百分吸光系數(shù)“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法計(jì)算濃度。 C未知0.010.1mg / ml6.2 分光光度計(jì)的組成和構(gòu)造：1. 組成：各種型號(hào)的紫外/可見(jiàn)分光度計(jì)，不論是何種型式，基本上都由五部分組成：（1）光源；（2）單色器（包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測(cè)器的光學(xué)系統(tǒng)）；（3）樣品室；（4）接收檢測(cè)放大系統(tǒng)；（5）顯示或記錄器。光 源 單色器 樣品室 檢測(cè)放大系統(tǒng) 顯示器國(guó)產(chǎn)分光光度計(jì)近年來(lái)已有很大的發(fā)展，各種檔次的分光光度計(jì)都已更新升級(jí)換代，可見(jiàn)

37、光系列有：721、722、723等型號(hào)，紫外/可見(jiàn)光系列有：751、752、753、754、756等型號(hào)，主要生產(chǎn)廠為上海分析儀器總廠等。我系1985年購(gòu)買(mǎi)的瑞士KONTRON康強(qiáng)公司生產(chǎn)的UNICON 860型紫/可見(jiàn)光分光光度計(jì)，是雙光束、快速自動(dòng)掃描、熒屏顯示的高檔分光光度計(jì)。這種雙光束分光光度計(jì)的特點(diǎn)是來(lái)自光源的連續(xù)光譜經(jīng)凹面全息光柵分光后，由出射狹縫得到單色光，經(jīng)過(guò)由電機(jī)帶動(dòng)的25周/秒左右的旋轉(zhuǎn)鏡分解為“樣品”、“參比”光束，順序分時(shí)通過(guò)參比池和樣品吸收池，照射到光電倍增管上，由于兩條光路是幾乎同時(shí)測(cè)量，參比信號(hào)又不斷與標(biāo)準(zhǔn)電壓比較，使參比信號(hào)恒定，所以由光源、單色器、外界雜光、光

38、電倍增管以及電源電壓等帶來(lái)的影響，儀器均能自動(dòng)消除。最快波長(zhǎng)掃描速度為1200nm/min，有五種測(cè)量功能和五種數(shù)據(jù)處理功能。我系2000年購(gòu)買(mǎi)的德國(guó)耶拿（蔡司）公司生產(chǎn)的SPECORD 200型高檔紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光路原理圖如下：SPECORD 200分光光度計(jì)的樣品和參比光路，分別有各自的帶溫控的光電二極管檢測(cè)器，因而取消了電機(jī)帶動(dòng)的旋轉(zhuǎn)鏡，大大提高了儀器的穩(wěn)定性及各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，其波長(zhǎng)范圍是190nm1100nm，吸光度測(cè)定范圍是03A，可變狹縫寬度為1nm、2nm和5nm，儀器使用微機(jī)控制時(shí)，掃描速度最高可達(dá)6000nm/min，寬大的樣品室可以安裝各種附件，儀器性能優(yōu)良，適合教

39、學(xué)、科研使用。該儀器的使用說(shuō)明詳見(jiàn)附錄。2. 構(gòu)造： 光源：理想光源的條件是：能提供連續(xù)的輻射；光強(qiáng)度足夠大；在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長(zhǎng)有明顯變化；光譜范圍寬；使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格低。用于可見(jiàn)光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogen lamp），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長(zhǎng)范圍是3201100nm。由于能量輸出的波動(dòng)為電壓波動(dòng)的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuterium lamp），適用波長(zhǎng)范圍是195400nm，由于氘燈壽命有限，國(guó)產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時(shí)左右，要注意節(jié)約燈時(shí)。 單色器：?jiǎn)紊魇欠止夤舛扔?jì)的心臟部分，它的

40、作用是把來(lái)自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長(zhǎng)。它的主要組成部件和作用是：入射狹縫限制雜散光進(jìn)入。色散元件即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。準(zhǔn)直鏡把來(lái)自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來(lái)自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。 出射狹縫只讓額定波長(zhǎng)的光射出單色器。轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡或光柵的波長(zhǎng)盤(pán)，可以改變單色器出射光束的波長(zhǎng)；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。光柵：光柵有透射光柵和反射光柵，實(shí)際應(yīng)用的都是反射光柵，它又可分為平面反射光柵（即通稱(chēng)的反射光柵或閃爍光柵）和凹面反射光柵兩類(lèi)，凹面反射光柵可以起色散元件和準(zhǔn)直鏡兩個(gè)作用，使色散后的光束聚焦于出射狹縫，

41、得到銳線光譜。光柵的刻制方法有兩種：機(jī)刻光柵：用金剛刀擠壓鍍于硬質(zhì)玻璃上0.51的鋁反射層而得。刻制工作量極大，一般每分鐘只能刻10條線，刻100mm寬的600線/mm的光柵要100小時(shí)。最多刻到3600線/mm。由于其制造周期長(zhǎng)，成本高，一般只能制得少量的母光柵，而實(shí)際應(yīng)用的多是復(fù)制光柵，即在母光柵上涂上硅油，再鍍上一層鋁，用環(huán)氧樹(shù)脂粘下來(lái)，就得到復(fù)制光柵。機(jī)刻光柵的缺點(diǎn)是線槽稍有缺陷時(shí)就會(huì)出現(xiàn)“鬼線”，即位于光譜強(qiáng)線兩側(cè)的模糊不清的假線。 全息光柵：用全息照相法刻制的高精度光柵。即用高強(qiáng)度的相干性極好的單色光，如激光，用高分辨的感光材料光致抗蝕劑記錄干涉條紋，曝光1小時(shí)，化學(xué)處理掉受光部分

42、，再進(jìn)行真空鍍膜（鍍鋁），得到全息反射光柵。這種光柵幾乎沒(méi)有線槽間的周期誤差，幾乎沒(méi)有“鬼線”，雜散光很少。最大線槽密度可達(dá)6500線/mm，最大直徑可達(dá)400mm，刻線越多，分辨率就越高，最常用的是12001500線/mm的全息光柵。狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率：出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法：一為狹縫的實(shí)際寬度，以毫米（mm）表示，另一種為光譜頻帶寬度，即指由出射狹縫射出光束的光譜寬度，以毫微米nm表示。例如，出射狹縫的寬度是6nm，并不是說(shuō)出射狹縫的寬度是6nm，而是指由此狹縫射出的光具有6nm的光譜帶寬。純粹的單色光只是一種理想情況，分光光度計(jì)所能得到的“單色光”，實(shí)際上只是具有一定波

43、長(zhǎng)范圍的譜帶，狹縫越寬，所包括的波長(zhǎng)范圍也愈寬。 對(duì)單色光純度來(lái)說(shuō)，狹縫是愈窄愈好，但光的強(qiáng)度也就越弱，因此狹縫不能無(wú)限制地小，狹縫的最小寬度取決于檢測(cè)器能準(zhǔn)確地進(jìn)行測(cè)量的最小光能量。目前達(dá)到的最小寬度為0.1nm。光譜有效頻帶寬度“b”是檢測(cè)器檢測(cè)到的光能量為峰值一半處的二點(diǎn)間的波長(zhǎng)間隔，如下圖所示： 光強(qiáng)度 Pb 光譜有效頻帶寬（nm）b 狹縫寬度（mm） 1/2h 線色散率 b 光譜有效頻帶寬b d波長(zhǎng)差 1/2hdS出射狹縫平面上二條 波長(zhǎng) 光線（d）所分開(kāi)的距離（mm） 由上式可以看出，b與b成正比， 與線色散率成反比。線色散率越大，則可得到的有效頻帶寬度越小。 光譜有效頻帶寬度檢查

44、方法如下： 用鈉光燈照明，在被測(cè)狹縫后測(cè)納雙線的光譜，并記錄和測(cè)量放大了的納雙線光譜圖。 589.6 nm 589.0 nm 75cm 5 cm 半峰寬 b 因?yàn)楣庾V圖由“nm”放大為“cm”，比例應(yīng)不變： d589.6589.00.6 (nm) b0.6×5750.04 (nm)分辨率：是儀器對(duì)相鄰的兩個(gè)峰可分辨的最小波長(zhǎng)間隔，是儀器分辨鄰近二條譜線的能力。分辨率 ： 例如若可分開(kāi)鈉雙線：則 高的分辨率可達(dá)：R=105。所以，狹縫寬度b越小，光譜帶寬b越小，分辨率就越高。何種情況算是能夠分辨：定義為二條譜線的峰與谷處于同一位置時(shí)，此二個(gè)峰認(rèn)為是剛好能分辨。由于光柵分光其色散是線性的

45、，所以只用一種狹縫寬度對(duì)各種波長(zhǎng)的光的測(cè)量，其分辨率都相同，即狹縫寬度不必經(jīng)常調(diào)節(jié)。只要光強(qiáng)能達(dá)到要求，應(yīng)使用盡可能小的狹縫寬度，以提高分辨率。 樣品室：包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為 0.1，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達(dá) 0.05。吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學(xué)玻璃杯因?yàn)槠胀ü鈱W(xué)玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見(jiàn)光，適用波長(zhǎng)范圍是400nm2000nm。石英玻璃杯可透過(guò)紫外光、可見(jiàn)光和紅外光， 是最常使用的吸收池，使用波長(zhǎng)范圍是180nm3000nm。吸收池的形狀有長(zhǎng)方形，方形和園筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容積3ml），光程要求極精確，透光的玻璃面要嚴(yán)格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭頭“”，標(biāo)明杯子使用時(shí)的透光方向，反方向使用會(huì)有偏差。有