代謝工程與合成生物學(xué)作業(yè)-生物元件

1、合成生物學(xué)之生物部件622（山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南，250100）摘要：合成生物學(xué)強(qiáng)調(diào)“設(shè)計(jì)”和“重設(shè)計(jì)”，其目的是通過人工設(shè)計(jì)和構(gòu)建自然界中不存在的生物系統(tǒng)來解決能源、材料、健康和環(huán)保等問題，其工程化的思想和標(biāo)準(zhǔn)化的工具一經(jīng)興起變得到全世界范圍的廣泛關(guān)注。生物系統(tǒng)的層次化結(jié)構(gòu)是合成生物學(xué)本質(zhì)化的典型體現(xiàn)，合成生物學(xué)系統(tǒng)中最簡(jiǎn)單最基本生物模塊被稱為生物部件（part），它是自下而上的研究策略中基礎(chǔ)部分，本文回顧了合成生物學(xué)中常用的生物部件級(jí)標(biāo)準(zhǔn)化使用方法，著重介紹了啟動(dòng)子和核糖開關(guān)的相關(guān)研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞：合成生物學(xué) 生物部件 生物元件1953年，年輕的J.D.Watson和F. Crick

2、從DNA的X射線的X衍射圖上解讀了雙螺旋結(jié)構(gòu)，隱藏了幾十億年的生物密碼逐漸露出端倪。2003年人類基因組計(jì)劃順利完成，此后包括人類在內(nèi)的各種生物的圖譜紛紛出爐，生物遺傳密碼的神秘面紗正在被迅速揭開。生物學(xué)由定性描述轉(zhuǎn)向定量計(jì)算，從分析到設(shè)計(jì)，進(jìn)入系統(tǒng)和合成生物學(xué)（synthetic biology）的的時(shí)代。目前合成生物學(xué)的定義還處于多元化階段，比較全面地可以概括為：合成生物學(xué)是指按照一定的規(guī)律和現(xiàn)有的知識(shí)，設(shè)計(jì)和建造新的生物部件、裝置和系統(tǒng)，或重新設(shè)計(jì)已有的天然系統(tǒng)為人類的特殊目的服務(wù)。從這個(gè)定義來看，合成生物學(xué)包含自下而上的研究策略和自上而下的研究策略，對(duì)于前者的探索是艱深而富有劃時(shí)代意義

3、的。合成生物學(xué)最終期望是借鑒電子學(xué)的方法能能像“搭積木”一樣構(gòu)建基因線路，而這最基本的就是模塊化元件。我們稱具有標(biāo)準(zhǔn)接口、功能相對(duì)獨(dú)立生物大分子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑、基因線路等為“模塊”（module）或生物積塊（BioBrick），模塊的規(guī)?？纱罂尚?，大致可分為部件（part）、裝置（device）、系統(tǒng)（System）及多細(xì)胞體系等幾個(gè)層次，其中最基礎(chǔ)的就是生物部件。模塊化設(shè)計(jì)體現(xiàn)了合成生物學(xué)的精髓，模塊往往具有信息隱藏，內(nèi)聚耦合，封閉性開放性的特性。常見的生物部件按照功能可以分為啟動(dòng)子（promoter）、核開關(guān)（Riboswithch）、RBS、終止子、操縱子、蛋白編碼基因（CDS）、報(bào)告基

4、因、標(biāo)簽組件、操縱子等，當(dāng)然這些分類層側(cè)不是絕對(duì)的。1. 啟動(dòng)子1.1 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，在原核生物和真核生物中是有差別的。1.1.1 原核生物中的啟動(dòng)子原核生物中的啟動(dòng)子通常，RNA聚合酶是依靠因子識(shí)別DNA上的特定序列，70是發(fā)現(xiàn)比較早也是比較常見的因子，它通常特異識(shí)別啟動(dòng)子的-10和-35兩個(gè)保守DNA盒子（如圖 1）。圖 1 原核生物中的啟動(dòng)子模式圖1.1.2真核生物中啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)相比原核生物的啟動(dòng)子，真核生物的啟動(dòng)子比較復(fù)雜，RNA聚合酶核心啟動(dòng)子是一個(gè)在轉(zhuǎn)錄過程中關(guān)鍵的但又容易被忽略的元件。核心啟動(dòng)子被定義為DNA的延伸，它涵蓋了RNA的起

5、始位點(diǎn)，典型的核心啟動(dòng)子大約有40到50核苷酸的長(zhǎng)度，它指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的起始。在過去，人們推測(cè)核心啟動(dòng)子在功能上是通用的，轉(zhuǎn)錄起始是通過一種共享通用的機(jī)制進(jìn)行的。最近的研究表明，各種核心啟動(dòng)子在結(jié)構(gòu)和功能上都存在相當(dāng)多的差異。存在大量的DNA元件作用于核心啟動(dòng)子的活性，給定核心啟動(dòng)子的特定性能是由這些核心啟動(dòng)子修飾因子的有無決定的。已知的核心啟動(dòng)子元件包括TATA盒子、Inr（起始子）、BREuATA盒子的上游的BRE TFB（RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄因子）識(shí)別元件和BREd（TATA盒子下游的BRE）、MTE（十基序元件）、DCE（下游核心元件）和DPE（下游核心啟動(dòng)子元件）（如圖 2）。圖 2 真

6、核生物中啟動(dòng)子模式圖1.2啟動(dòng)子的種類在合成生物學(xué)以及以前的生物學(xué)研究中，我們已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化了許多啟動(dòng)子元件（如表格 1）。最經(jīng)典的啟動(dòng)子是乳糖操縱子中的乳糖啟動(dòng)子，它可以被乳糖誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)中我們常用IPTG誘導(dǎo)；色氨酸啟動(dòng)子引人注意的特性是有一段弱化子，可以根據(jù)細(xì)胞環(huán)境中色氨酸的濃度調(diào)控后續(xù)基因的表達(dá)；tac啟動(dòng)子則是上述兩種啟動(dòng)子的融合啟動(dòng)子，是典型常用的強(qiáng)啟動(dòng)子；Pl、Pr是噬菌體溶源和裂解生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)化及維持中的重要啟動(dòng)子，阻遏蛋白的溫度敏感突變可以使其收溫度誘導(dǎo)；PtetA基因也是很常用啟動(dòng)子之一，可以被脫水四環(huán)素誘導(dǎo)；T7啟動(dòng)子則是比較特殊一種啟動(dòng)子，對(duì)RNA聚合酶的種類有特異性。表格 1

7、 常見啟動(dòng)子的概述啟動(dòng)子名稱英文表示調(diào)節(jié)基因誘導(dǎo)物備注乳糖啟動(dòng)子PlacZlacI異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)負(fù)反饋色氨酸啟動(dòng)子PtrptrpR - trp可阻遏負(fù)反饋（！弱化子）tac啟動(dòng)子PtaclacIq IPTG、乳糖、溫度敏感拼合啟動(dòng)子啟動(dòng)子Pl、PrPl/PrcIts857溫度敏感可誘導(dǎo)負(fù)反饋四環(huán)素溢出泵基因啟動(dòng)子PtetAtetR蛋白家族四環(huán)素（Tc）脫水四環(huán)素（aTc）可誘導(dǎo)負(fù)反饋T7啟動(dòng)子Pt7 大腸桿菌的RNA聚合酶不能識(shí)別，但噬菌體及真核生物的RNA聚合酶可以1.3啟動(dòng)子的調(diào)控及意義為實(shí)現(xiàn)一些特定目的，微生物系統(tǒng)工程需要一些設(shè)計(jì)工具，這些工具以某種可預(yù)測(cè)

8、的、定量的方式起作用。在合成生物學(xué)的領(lǐng)域，基因之間級(jí)聯(lián)調(diào)控很多都是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平（如圖 3），而這些往往是在轉(zhuǎn)錄起始階段起作用，也就是說與啟動(dòng)子有關(guān)，因此標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)啟動(dòng)子對(duì)整個(gè)系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)有重要意義。圖 3 在轉(zhuǎn)錄水平控制基因表達(dá)的設(shè)計(jì)工具在自下而上的研究策略中，我們往往用基因線路模擬一些電子學(xué)上的邏輯開關(guān)，從簡(jiǎn)單邏輯或與非，到雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)，再到震蕩子（如圖 4）實(shí)質(zhì)上都是上面提到的啟動(dòng)子及其調(diào)控基因按照一定次序設(shè)計(jì)排列的結(jié)果。此外，在合成生物學(xué)學(xué)術(shù)比賽iGEM中，相當(dāng)多的隊(duì)伍作品的關(guān)鍵都是發(fā)現(xiàn)或者標(biāo)準(zhǔn)化了一些有特殊功能啟動(dòng)子及其相關(guān)組件，比如感光、溫度敏感、感受重金屬離子等。圖 4 雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)（

9、左）及震蕩子（右）的邏輯結(jié)構(gòu)2核糖開關(guān)在1991年，人們就發(fā)現(xiàn)E.coli的btuB基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5-UTR存在高度保守序列，并發(fā)現(xiàn)Ado-cbl和B12可以使btnB基因表達(dá)，但沒有發(fā)現(xiàn)可以與Ado-cbl結(jié)合的蛋白因子；1990年，Andrew從隨即合成的RNA序列中篩選出特異性結(jié)合有機(jī)染料配體的RNA，并命名為“aptamer”（適體）；2002年，Breaker受到適體的啟發(fā)，證明了這種天然適體的存在，命名為“核糖開關(guān)”。到目前（2009年）為至已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少于 12 個(gè)核糖開關(guān)（如表格 2表格 1），大部分是抑制性的（當(dāng)存在相應(yīng)代謝物時(shí)基因關(guān)閉）。主要參與氨基酸、核苷酸、維生素等基礎(chǔ)物

10、質(zhì)的代謝。表格 2 一些已知的Riboswithch的名稱、調(diào)節(jié)小分子和功能核糖開關(guān)中，mRNA 本身作為傳感器 ,直接感受環(huán)境中相應(yīng)代謝物的變化 ,結(jié)合代謝物后發(fā)生構(gòu)象變化 ,在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。核糖開關(guān)也是一種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制 ,與以往發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)機(jī)制的區(qū)別是：它不需要任何蛋白質(zhì)（乳糖操縱子）或核糖體（色氨酸弱化子）作為中介 ,由 RNA 直接感受環(huán)境中代謝物的變化 ,通過形成選擇性莖環(huán)結(jié)構(gòu) ,在轉(zhuǎn)錄延伸和翻譯起始水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。2.1核糖開關(guān)的作用機(jī)制已發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌核糖開關(guān)均位于代謝相關(guān)基因mRNA的 5UTR，由 2 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成 :適體結(jié)構(gòu)域(aptamer domain，AD

11、) 和 表 達(dá) 結(jié) 構(gòu) 域 ( expression domain, EPD)。AD 直接結(jié)合小分子代謝物，是RNA 傳感器. 序列分析表明，在不同細(xì)菌的同類核糖開關(guān)中，AD 序列保守，形成高度相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。與配體結(jié)合后，AD 發(fā)生構(gòu)象變化，信息傳遞至 EPD ，后者通過形成選擇性莖環(huán)結(jié)構(gòu)，直接調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。不同核糖開關(guān)的 EPD 可能利用不同的機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)。（如圖 5）目前發(fā)現(xiàn)的真核生物的核糖開關(guān)位于 3UTR 或內(nèi)含子，也具有相似的 AD 和 EPD，可能在多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)真核生物基因表達(dá)。圖 5 核糖開關(guān)的作用機(jī)制為研究核糖開關(guān)的作用機(jī)制，F(xiàn).J.Isaacs等構(gòu)建了人工的Ribos

12、withch（如圖 6），這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控比轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控更加迅速?；蛘１磉_(dá)時(shí)，啟動(dòng)子P控制gfp的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄形成的mRNA的RBS暴露在外，一旦核糖體識(shí)別并與之結(jié)合以后，mRNA既可以翻譯成蛋白質(zhì)。而在人工構(gòu)建Riboswithch中，在啟動(dòng)子Pcr和RBS中間插入一段與RBS互補(bǔ)的cr序列。轉(zhuǎn)錄后mRNA5與RBS結(jié)合形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，將RBS掩蓋阻止核糖體與之結(jié)合，從而組織翻譯的進(jìn)行。另一個(gè)啟動(dòng)子Pta啟動(dòng)后表達(dá)一個(gè)短鏈非編碼RNAtaRNA。taRNA能以高度特異性優(yōu)先定位于crRNA，共經(jīng)過線性-環(huán)相互作用將crRNA的發(fā)卡環(huán)解開，taRNA的尾部與crRNA互補(bǔ)配對(duì)。此時(shí)，crRNA

13、的RBS位點(diǎn)暴露在外，核糖體可與之結(jié)合重新激活翻譯。2.2核糖開關(guān)的應(yīng)用2.2.1小分子抗菌藥物riboswitch 在人類細(xì)菌性病原體內(nèi)分布廣泛（如），預(yù)示著將riboswitch 作為藥靶將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。臨床上一些常用抗菌藥物的毒性機(jī)制已經(jīng)被證實(shí)是以riboswitch 為藥靶的例如吡啶磺胺(pyrithiamine，PT)，一種常用的硫胺代謝對(duì)抗物，是維生素B1 （Thiamine ，硫胺素）的類似物。它在細(xì)胞內(nèi)很容易磷酸化成吡啶磺胺焦磷酸鹽PTPP)。PTPP 可以與許多TPP riboswitch 結(jié)合(其親和性與TPP 類似)，從而抑制由TPP riboswitch 控制的基

14、因表達(dá)。圖 6 用于控制轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的人工Riboswithch系統(tǒng)表格 3 一些含有Riboswithch調(diào)控的人類細(xì)菌性病原體2.2.2細(xì)菌趨向運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的趨向運(yùn)動(dòng)的研究在生物降解、生物納米、合成生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義。Shana Topp等人在大腸桿菌中設(shè)計(jì)一個(gè)通過小分子和mRNA來指導(dǎo)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的系統(tǒng)。在野生型的大腸桿菌中，鞭毛馬達(dá)的旋轉(zhuǎn)方向有蛋白CheY控制，當(dāng)CheY沒有被磷酸化時(shí)，鞭毛馬達(dá)逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)；當(dāng)CheY被磷酸化后，CheY-P可以和鞭毛馬達(dá)蛋白FliM結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞滾動(dòng)；因此野生型大腸桿菌可以在半固體瓊脂上遷移。然而，在CheZ蛋白缺失時(shí)，CheY-P不能去磷酸化，細(xì)胞只

15、能翻滾不能遷移。（如圖 7）研究人員在CheZ蛋白的編碼基因前設(shè)計(jì)了核糖開關(guān)（如圖 8左），它只有和茶堿結(jié)合后才能改變構(gòu)型與核糖體結(jié)合翻譯出CheZ使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。所以導(dǎo)致了改造后的大腸桿菌只會(huì)在有茶堿存在的區(qū)域遷移（如圖 8右）。圖 7 大腸桿菌CheY與其運(yùn)動(dòng)的關(guān)系圖 8 Riboswithch設(shè)計(jì)（左）與實(shí)驗(yàn)結(jié)果（右）3.生物部件的討論生物部件是最簡(jiǎn)單、最基本的生物積塊，能有通過標(biāo)準(zhǔn)化的組裝方法與其他part組裝成更加復(fù)雜的模塊。目前，生物部件的數(shù)量和質(zhì)量都達(dá)不到合成生物學(xué)所期望的要求。部件的開發(fā)存在一些問題。如此龐大的部件庫需要對(duì)每個(gè)部件進(jìn)行恰當(dāng)?shù)拿?，這一點(diǎn)通過嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)范去實(shí)現(xiàn)并不難。

16、生物部件之間的連接之前也是一個(gè)大問題，往往通過復(fù)雜的酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)，但隨著一些新的組裝手段的出現(xiàn)，這變得很容易。比較難以解決的問題是標(biāo)準(zhǔn)定量機(jī)制，雖然已經(jīng)有了PoPS（RNA polymerase per second）、RIPS（ribosonmal initiations per secon）的概念，但是這只是具有一定量化作用的抽象概念，合成生物學(xué)基因部件定量的標(biāo)準(zhǔn)化還遠(yuǎn)不及模塊本身的進(jìn)程那么快速普遍，許多研究者正在尋找更加通用、更加直觀的衡量方法和更直接的測(cè)量手段。參考文獻(xiàn)1.Molecular Biology of the Gene sixth edition2.合成生物學(xué)導(dǎo)論

17、宋凱編著3. Perspectives On The RNA Polymerase II Core Promoter Biochemical Society Transactions, 2006, 34(Pt 6): 1047-1050.4. Seo S W, Yang J, Min B E, et al. Synthetic biology: Tools to design microbes for the production of chemicals and fuelsJ. Biotechnology advances, 2013, 31(6): 811-817.5.趙文超, 薛永常, 王雪霞. 核糖開關(guān)一種基因表達(dá)調(diào)控元件J. 生命的化學(xué), 2009 (1): 56-59.6.趙謹(jǐn), 楊克恭, 張學(xué). 一種新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制核糖開關(guān)J. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 200