細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功與否的八大要素

1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功與否的八大要素摘要 : 轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多， 如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型 （對于困難的細(xì)胞系尤其如此 ），需要被轉(zhuǎn)染的分子 （DNA、RNA 、寡核苷酸、 蛋白質(zhì) ），轉(zhuǎn)染試劑等。但無論在何種情況下，轉(zhuǎn)染的成功均取決于知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆。做細(xì)胞轉(zhuǎn)染也一樣道理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型（對于困難的細(xì)胞系尤其如此 ），需要被轉(zhuǎn)染的分子 （DNA 、RNA 、寡核苷酸、蛋白質(zhì) ），轉(zhuǎn)染試劑 等。但無論在何種情況下，以下八個(gè)要素都不容忽視。要素一： 細(xì)胞分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞 分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源 DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，

2、細(xì)胞都在 轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。 同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài) ;此外，還常用促有絲分裂刺激物 （如，病毒轉(zhuǎn)化， 生長因子，條件培養(yǎng)基，以及滋養(yǎng)細(xì)胞 ）來活化原代培養(yǎng) 細(xì)胞。貼壁細(xì)胞相比較 懸浮細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。相對于貼壁細(xì)胞 （如 HEK，CHO），懸浮細(xì)胞 （如 HL 60 ，Jurkat）非常難以轉(zhuǎn)染，可能是因?yàn)榧?xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異，但目前還沒有分子水平上合理機(jī)制的解釋。分板方案在對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分板傳代培養(yǎng)之前，必須把貼壁細(xì)胞用 胰蛋白酶 消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個(gè)常規(guī)操作可導(dǎo)致正 常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害。因此分批方案的不同 （

3、如，胰蛋白酶消化時(shí)間的長短，胰蛋白酶的滅活等 ）需要優(yōu)化。傳代次數(shù)傳代次數(shù)是指對一個(gè) 細(xì)胞系 進(jìn)行分批傳代的頻度 （通常在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi) ）。某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較 不穩(wěn)定，可能會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而改變，視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而定。因此名稱相同的同一細(xì)胞系在生理學(xué)和形態(tài)學(xué)（以及轉(zhuǎn)染能力）性質(zhì)也可能會(huì)有很大的差異。一般而言，細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。細(xì)胞數(shù)量（融合率）只要培養(yǎng)基質(zhì) （組織培養(yǎng)皿 ）尚有空間，細(xì)胞就會(huì)按指數(shù)規(guī)律分裂。對于正常細(xì)胞而言， 細(xì)胞生長的速度受細(xì) 胞密度大小的抑制 （接觸抑制 ），但癌細(xì)胞則不受此限制而會(huì)繼續(xù)生長并可互相疊

4、加。營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會(huì)影響所有的 細(xì)胞生長。細(xì)胞會(huì)因受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。報(bào)告基因的表達(dá)率與轉(zhuǎn)染開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞健康以及細(xì)胞溶解之前 的生長情況相關(guān)。培養(yǎng)物污染 培養(yǎng)物可被細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類所污染。各種污染都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。支原體污染 支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為 5-35% ，它可改變細(xì)胞生長特性，酶的作用途徑，細(xì)胞膜的組成，染色體 結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是，支原體對采用脂質(zhì)、 DEAE- 右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾，其結(jié)果致使非典型轉(zhuǎn) 染或轉(zhuǎn)染效率偏低。這些影響會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠以及時(shí)間

5、和珍貴細(xì)胞系的損失。和細(xì)菌及真菌不同，支原體污染無法通過視覺檢 查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過大多數(shù)的無菌濾膜 ;它們還對常用抗生素有抗藥性。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。要素二：載體 DNA一般原則：對純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在測定細(xì)胞體系的參數(shù) 時(shí)，一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。載體的完整性 載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺 旋斷裂、核酸酶的降解，以及來自于儲(chǔ)存和處理過程中的物理壓力的影響。載體制備物 各種載體是按照不同的方案在細(xì)菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物

6、中殘余的污染物（如 CsCl ，內(nèi)毒素）可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。載體構(gòu)造（啟動(dòng)子/增強(qiáng)子/ORI）轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件 （如， RSV ，CMV ，和 SV40）的對照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。 然而，病毒啟動(dòng)子 /增強(qiáng)子體系的相對有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，在某些細(xì)胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增， SV40 體系可高效表達(dá) large T 抗原 （如， COS）;而在其他許多細(xì)胞系中，則是 CMV 啟動(dòng)子更為有效。除此之外，各種 CMV 載體的表達(dá)率也會(huì)有超過一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。要素三：組織培養(yǎng)試劑一般原則：優(yōu)化您的細(xì)胞生長條件。只使

7、用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更?；A(chǔ)培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì) （氨基酸，葡萄糖 ），維生素，無機(jī)鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果 在使用時(shí)不是新鮮，加入就可能會(huì)產(chǎn)生問題。配置時(shí)要使培養(yǎng)基務(wù)必避光保存;因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì)，如 HEPES ，當(dāng)暴露于光照下就會(huì)分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。胎牛血清 血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長促進(jìn)因子和生長抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動(dòng)物的年齡、 營養(yǎng)水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量，從而引起顯著生物學(xué)變化。添加劑 某些細(xì)胞的生長依賴于一些對生命力或細(xì)胞分裂必不可少的物質(zhì) （如，生長因

8、子，微量元素，必需代謝物和蛋白等 ）。CO2 培養(yǎng)箱細(xì)胞生長所需環(huán)境為 37、相對濕度為 95%的CO2 培養(yǎng)箱。用 CO2是為了控制 pH值，細(xì)胞生理對 pH的變 化非常敏感， 因此多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。 有些培養(yǎng)基需要 CO2 濃度為 5%來有效控制 pH 值，而另一些則需要 10% 的 CO2 。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對一下適當(dāng)?shù)?CO2 濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致 （溫度、濕度和 CO2） 則會(huì)導(dǎo)致 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的板間變異。來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì)，或真菌/細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理。要素四：使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白以往為了獲得

9、蛋白質(zhì)的高表達(dá)產(chǎn)量，必須先轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后挑選一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行蛋白的擴(kuò)增和富集。而挑選這樣一個(gè) 細(xì)胞系往往需要花費(fèi)數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間，這既可能是由于試劑的細(xì)胞毒性也可能是由于轉(zhuǎn)染的低效率。如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞 毒性，那么只有少數(shù)細(xì)胞能夠存活，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的產(chǎn)量很低。而如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染成功的細(xì)胞太少，那么那些未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長速度 大大超過轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，其結(jié)果同樣也只能產(chǎn)生少量的目標(biāo)蛋白。使用一種溫和的可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑，就可獲得蛋白質(zhì) 的高表達(dá)。現(xiàn)將一些影響蛋白高效表達(dá)的關(guān)鍵因素分列如下：細(xì)胞系 （有些類型的細(xì)胞比其他細(xì)胞產(chǎn)量高 ）質(zhì)粒骨架 （例如：增強(qiáng)子，啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄調(diào)

10、控元件 ）目的蛋白 （有些蛋白很難獲得高表達(dá)量 ）目的蛋白的 cDNA 序列 （例如：密碼子的優(yōu)化 ）培養(yǎng)條件 （營養(yǎng)物，代謝廢物，轉(zhuǎn)染抑制物 ）當(dāng)這些因素都得到優(yōu)化，并加入合適配比和數(shù)量的轉(zhuǎn)染復(fù)合物 （轉(zhuǎn)染試劑 -質(zhì)粒）后，就可獲得至少達(dá)到平均表達(dá)水平的穩(wěn)定表達(dá)克 隆。要素五：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染制備一種穩(wěn)定細(xì)胞系的第一步是選擇一種同時(shí)含有選擇性標(biāo)記物和目的基因的載體。選擇性標(biāo)記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或 者酶來幫助細(xì)胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。一旦選好了質(zhì)粒載體，無論瞬時(shí)或者穩(wěn)定表達(dá)都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法。在加入選擇性試劑之前，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)過夜。這樣就使細(xì)胞有

11、時(shí)間表達(dá)足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用。細(xì)胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長。那 些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞即被殺死。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠生長。有的時(shí)候，還可以將選擇性試劑持續(xù)加入到培養(yǎng)基中，以維 持對細(xì)胞的選擇壓力。要素六：轉(zhuǎn)染方案一般原則：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案 ;首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開始，然后通過改變試劑 /DNA 的配比和復(fù)合物的劑量進(jìn)行優(yōu)化。 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備 諸如轉(zhuǎn)染試劑 /DNA 配比，離子強(qiáng)度，緩沖液 pH 值，以及溫度等變量都會(huì)影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能。 質(zhì)?？捎脽o菌水或 TE 緩沖液稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑，就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說明。

12、在不含血清或其他 蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物 ;如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會(huì)對轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的最佳孵育時(shí)間是 一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。轉(zhuǎn)染試劑 /DNA 配比（負(fù)載比）所有的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)在某一個(gè)試劑 /DNA 配比時(shí)最為有效。有時(shí)候這種最佳配比的所在范圍非常 狹窄;而且對于每種實(shí)驗(yàn)體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到最佳配比。形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑 對于多數(shù)試劑而言，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基或鹽溶液中形成。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的加入 有兩種替換方法可用來將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞： 1.將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者 2.

13、將轉(zhuǎn)染復(fù) 合物先用培養(yǎng)基稀釋，然后進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作。第一種方法更簡便，而第二種方法則更因?yàn)楸苊饬嗽噭┰诰植繚饩鄱a(chǎn)生毒性，所以 會(huì)使結(jié)果的一致性更好。要素七：時(shí)間進(jìn)度一般原則提示：要確保最終結(jié)果的成功 ;建立一個(gè)合適的時(shí)間進(jìn)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以保證您所需要的目的蛋白能得到最佳表達(dá)。轉(zhuǎn)染的開始在轉(zhuǎn)染前 12小時(shí)，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中。在細(xì)胞達(dá)到 50-80% 的融合率時(shí)開始轉(zhuǎn)染，這樣就可以使它們在實(shí)驗(yàn) 結(jié)束時(shí)達(dá)到接近 100%的融合。細(xì)胞對轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在 0.5-6 小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成。在這段時(shí)間后，就不會(huì)再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所 增長。培養(yǎng)基更換 某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)

14、染必須在沒有胎牛血清存在的條件下進(jìn)行，那么這一步驟 就必不可少。而對于可在血清存在的情況下使用的無毒性轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達(dá)階段，就可以省略這一步。如 果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在培養(yǎng)基中直到進(jìn)行檢測，那么對有些細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率會(huì)有所提高，而另外一些細(xì)胞在轉(zhuǎn)染開始幾個(gè)小時(shí)之后其 轉(zhuǎn)染效率就不會(huì)再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑 /DNA 復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除，但在此后的長期生長階段換用 新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉(zhuǎn)染細(xì)胞需要生長 3-7 天，換培養(yǎng)基就尤其重要，這樣一來就使它們有時(shí)間達(dá)到最高的蛋白表達(dá)量。時(shí)間測定轉(zhuǎn)染開始后的 24-48 小時(shí)內(nèi)，報(bào)告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加 ;而這種增加取決于增強(qiáng)子的強(qiáng)度、 表達(dá)外源蛋白中所涉 及的細(xì)胞反應(yīng)，存活細(xì)胞的健康狀態(tài)，以及營養(yǎng)因素等。在轉(zhuǎn)染后等待 3-7 天收集蛋白進(jìn)行純化較為常見了。最后就是平時(shí)可能會(huì)忽略的轉(zhuǎn)染試劑本身的脫靶效應(yīng) off-target effect ，轉(zhuǎn)染試劑本身對基因表達(dá)水平 （ 高表達(dá)或低表達(dá) ）的影響， 有時(shí)候可能會(huì)造成假陽性的結(jié)果。我自己的體會(huì)是，一般的細(xì)胞，用脂質(zhì)體 2000 和 fugeneHD 轉(zhuǎn)染效率相差不大，雖然最近有文獻(xiàn)說脂質(zhì)體 2000 脫靶效應(yīng)很高， 但國內(nèi)在乎的人貌似不多 ;但是干細(xì)胞，原代細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等一些比較難轉(zhuǎn)的細(xì)胞系， Fugene