Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

1、Sf-9細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞 Sf-9Sf-9細(xì)胞是由細(xì)胞是由G.E. Smith G.E. Smith 和和 C.L. Cherry C.L. Cherry 在在19831983年從細(xì)胞株年從細(xì)胞株IPLB-SF 21 AEIPLB-SF 21 AE得來(lái)的一得來(lái)的一個(gè)克隆。個(gè)克隆。IPLB-SF 21 AEIPLB-SF 21 AE是是19771977年由年由VaughnVaughn等從草地夜蛾蛹的卵巢組織得到的。等從草地夜蛾蛹的卵巢組織得到的。 Sf-9Sf-9是半貼壁的細(xì)胞，貼壁性不強(qiáng)，可貼是半貼壁的細(xì)胞，貼壁性不強(qiáng)，可貼壁培養(yǎng)也可懸浮培養(yǎng)。壁培養(yǎng)也可懸浮培養(yǎng)。Sf-9細(xì)胞的形態(tài)

2、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件 1、細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要 2、細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 28 氧 pH: 7.2-7.4 滲透壓 3、無(wú)污染 4、無(wú)毒實(shí)驗(yàn)材料： 實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品： 超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸 生化培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡 酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器 液氮罐 自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀 耗材耗材： 培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。 生化培養(yǎng)箱 生化培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為28 。 使用生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題： 1）保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣

3、干凈。定期消毒（90 ，14 h)。 2）箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000ml蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。 培養(yǎng)瓶拿培養(yǎng)瓶的正確姿勢(shì)：拇指和食指夾住培養(yǎng)瓶，拿培養(yǎng)瓶的正確姿勢(shì)：拇指和食指夾住培養(yǎng)瓶，瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平，瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平，防止培養(yǎng)液倒向瓶口。防止培養(yǎng)液倒向瓶口。血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，

4、目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序 標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25 以上時(shí)， 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時(shí)， 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存 簡(jiǎn)易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系 以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按 每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至 液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。細(xì)胞復(fù)蘇方法 （1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。 （2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。 （3）低速離心10分鐘。 （4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。

5、Sf9細(xì)胞的傳代 判斷分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物是否需要傳代的主要指標(biāo)就是觀察培養(yǎng)物是否已基本長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶皿的底壁。 一般來(lái)說(shuō)，原代培養(yǎng)物未達(dá)到生長(zhǎng)基質(zhì)的80%表面面積，不要急于傳代，對(duì)于擬行首次傳代的培養(yǎng)物更如此。 Sf9的分裂周期大概是27小時(shí)左右Sf9傳代的方法 1）吸取或者傾出舊培養(yǎng)液。 2）加入一定量的新培養(yǎng)基，用吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶皿底壁，使半貼壁的細(xì)胞脫離瓶皿底壁。 吹打過(guò)程須有序進(jìn)行，亦即要從一邊開(kāi)始到另一邊結(jié)束，尤其是器皿的邊緣地帶和四角處，確保瓶皿底壁各處的細(xì)胞均被吹打脫離。吹打時(shí)動(dòng)作不宜過(guò)猛，吹出液體的力度要適中，否則會(huì)直接損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。或者使細(xì)胞碎片增多

6、。 經(jīng)吹打后，得到細(xì)胞懸液。Sf9傳代的方法 3）接種在新的培養(yǎng)瓶皿內(nèi)。一般接種兩個(gè)或者多個(gè)培養(yǎng)瓶皿內(nèi)。 有時(shí)候，傳代僅為了使培養(yǎng)物經(jīng)歷并適應(yīng)傳代處理過(guò)程，在培養(yǎng)物細(xì)胞數(shù)量不大的情況下，傳代時(shí)還只是接種在一個(gè)培養(yǎng)瓶皿內(nèi)。加入培養(yǎng)液。（平時(shí)不做實(shí)驗(yàn)時(shí)，只需要傳一瓶）。 （以1：5或更多為宜，每2-3天傳代一次） 28培養(yǎng)（不用CO2培養(yǎng)箱）。 4）送入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)換液 對(duì)于像Sf9這樣的半貼壁的培養(yǎng)物，可按如下步驟操作： 吸去或傾出（部分或全部）舊培養(yǎng)液。 加入新鮮的培養(yǎng)液。加入的量與換液前的量相同。 放回原來(lái)的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染(transfection)指真核細(xì)胞由于

7、外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過(guò)程。 化學(xué) 包括：DEAE-葡聚糖法磷酸鈣法人工脂質(zhì)體法 物理 包括：顯微注射電穿孔基因槍 *BacmidBac-to-Bac expression system 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Baculovirous Expression Vector System,BEVS）與細(xì)菌，酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞一起被公認(rèn)為當(dāng)今世界的基因工程的四大表達(dá)系統(tǒng)。特點(diǎn) 能對(duì)高效表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行較完善的翻譯后加工，如糖基化，磷酸化，?；盘?hào)肽的切除等； 與其他真和細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比能獲得重組蛋白的高水平表達(dá)，最高甚至可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50%； 對(duì)脊椎動(dòng)物無(wú)感染性，并且也已經(jīng)證明它們的

8、啟動(dòng)子在大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也是沒(méi)有活性的，因此這對(duì)于表達(dá)一些致癌基因和潛在的毒蛋白比其他的表達(dá)系統(tǒng)更有優(yōu)勢(shì)； 能容納大分子片段的插入和表達(dá)； 能同時(shí)在一個(gè)細(xì)胞和載體上表達(dá)多個(gè)外源基因； 能保證高表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確的折疊，二硫鍵的搭配等。桿狀病毒 現(xiàn)已知基因組全序列的桿狀病毒僅有7 種: 苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒( AcMNPV ) 家蠶核多角體病毒( BmNPV ) 黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒( OpMNPV ) 舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒( LdMNPV ) 甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒( SeMNPV) 棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒( HaNPV) 斜紋夜蛾核型多角體病毒( S

9、pltMNPV) 多角體蛋白 多角體蛋白是形成包含體（在顯微鏡下可以識(shí)別的病毒合成和積貯的部位，常是細(xì)胞內(nèi)的病毒晶體。它是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚體，包含大部分的表達(dá)蛋白。 ）的主要成分，感染后期在細(xì)胞中的積累可高達(dá)30% 50%，是病毒復(fù)制非必需成分，但對(duì)病毒粒子卻有保護(hù)作用，可使之保持穩(wěn)定和感染能力。Bacmid 能快速、高效產(chǎn)生的重組AcMNPV 病毒。取桿狀病毒( baculovirus) 和質(zhì)粒( plasmid) 的英文字頭字尾命名為Bacmid，即桿狀病毒質(zhì)粒之意。該載體可像質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中生長(zhǎng)，又對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞具有感染性。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成表達(dá)過(guò)程：1、將外源目的基因插入到啟動(dòng)子下游與桿狀病毒重組，獲得重組病毒（酶切酶連轉(zhuǎn)化）2、將重組的病毒純化3、感染昆蟲(chóng)細(xì)胞或蟲(chóng)體（轉(zhuǎn)染）4、外源基因隨著病毒的復(fù)制而獲得表達(dá)*人細(xì)小病毒B19-XA株VP1蛋白在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達(dá)及其反應(yīng)原性*Bac-toBac Baculovirus Expre