T載體與目的基因連接

1、 一.重組質粒的構建T質粒載體 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。 DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接 酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連 接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連 接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA 連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化 DNA連接反應分為3步：首先，T4DNA

2、連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物；然后，酶-ATP復合物再結合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺昔化； 最后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。 很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產物雙鏈DNA每條鏈的3端加上一個突出的堿基AopUCm-T載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3端帶有一 個突出的To這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產物的兩端進行正確的AT配對， 在連接酶的催化下，就可以把PCR產物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的 重組載體。 連接反應的溫度在37C時有利于連接酶的活性。但是在這個溫

3、度下粘末端的氫鍵 結合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16C,連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩(wěn)定。 二.感受態(tài)制備原理 細菌在0 CCaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態(tài)。 三.B-半乳糖甘酶顯色反應選擇法 LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個基因，可以編碼3半乳糖核甘酶。 3一半乳糖核甘酶是由4個亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解.用X-Gal為底物 進行染色時，呈藍色。 現(xiàn)在一些特定的質粒（比如pUC/pBS等），常帶有3半乳糖核甘酶的調控序列和3半乳糖核甘酶N端146個氨基酸（“肽段）

4、的編碼序列，在這個編碼序列里還 插入一個多克隆位點（MCS，它并不影響lacZ的表達。另外，常用的大腸桿菌帶有 3一半乳糖核甘酶C端部分序列（3肽段），的編碼序列。在各自獨立的情況下，這 些質粒與大腸桿菌各自編碼的3半乳糖核甘酶片段都沒有酶的活性。 只有當攜帶“ 肽編碼信息的克隆載體成功進入宿主細胞，在培養(yǎng)基誘導物IPTG的誘導下，載體質 粒能夠合成3一半乳糖核甘酶N端（“肽段），這樣就與宿主細胞合成的3一半乳糖 核音酶C端部分序列（3肽段）互補，形成完整的3一半乳糖核甘酶活性蛋白。 而當外源基因插入到此種載體質粒lacZ的多克隆位點后，會造成lacZ基因不能 表達，從而不能合成3一半乳糖核甘

5、酶；而對于空載體，lacZ基因正常表達，通過“ 互補合成3一半乳糖核甘酶，分解培養(yǎng)基里的色素底物X-gal,最終形成藍色的化合 物，出現(xiàn)藍色菌斑。實驗準備：清洗，5個100ml錐形瓶（外加1個小的），6副培養(yǎng)皿，3個小試劑瓶， 接種環(huán)，涂布棒。準備100ml超純水。溶液:LB300ml（液體50ml+50ml,固體100ml）,LCaCl210ml,100mg/mlAmp1ml,20mg/mlX-gal1ml,200mg/mlIPTG1ml。大腸桿菌菌液 1ml。 感受態(tài)細胞 連接產物 4管 4x5=20ul 做4份 目的基因 T載體 T4連接酶 10 x沖液 4x4uL 4x1uL 4x1u

6、L 滅菌：5個100ml錐形瓶（外加1個小的），6副培養(yǎng)皿，3個小試劑瓶，接種 環(huán)，涂布棒，10ml超純水，LB培養(yǎng)基，管，大小槍頭，過濾用具2副，LCaCl2 實際配置20mg/mlX-galX-gal為5-澳-4-氯-3-口引喋-3-D半乳糖甘。用二基甲酰 胺（DMF溶解X-gal配制成的20mg/ml（取，用DMF定容為1ml）的貯存液。保存于 一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞， 并應貯存于-20C。X-gal溶液無須過濾除菌。（DMF二甲基甲酰胺;Dimethylformamide; N,N-Dimethylformamide;DMF;CA

7、S:68-12-2理化性質：無色、淡的胺味的液體。 分子式C3-H7-N-O。分子量。相對密度（25C）。熔點-61Co沸點C。）溶于DMSQ 溶解度可達20mg/ml。也溶于DMF溶于DMSQ溶解度可達20mg/ml。也溶于DMF 200mg/mlIPTG在蒸儲水中溶解IPTG后，用蒸儲水定容至1ml,用科m濾器過 濾除菌，貯存于-20C。 LB培養(yǎng)基： 配制每升培養(yǎng)基 5gNaCl10g搖動容器直至溶質溶解.用5mol/LNaOH調pH至.用去離子水定容至1L. 在15Psi高壓下蒸汽滅菌20min.（100mlLB培養(yǎng)基加入瓊脂粉為固體培養(yǎng)基） LCaCl2:取氯化鈣固體定容至10ml

8、Amp100mg/ml）:溶解氨葦青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至1ml, 用mm濾膜過濾除菌. 實驗過程 （一） .目的基因片段與載體連接 器材 旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，管架，臺式離心機，干式恒溫氣浴。 試齊I T載體，T4DNA連接酶，連接酶緩沖液，無菌 操作步驟 PCR產物與T載體直接連接： （1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設定在1416 C （2） 取4個滅菌的200ul微量離心管，加入：（需要調整）4ml目的基因； 1mlT載體；T4DNA連接酶（TAKARA,350U/ul）;1ml連接酶緩沖液10 xbuffer;mlddWater，總量10ml體系

9、。 （3） 述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14。C干式恒溫儀（或14。C水中）中保溫過夜（12-16h）。 （4） 連接后的產物可以立即用來轉化感受態(tài)細胞或置4。C冰箱備用。 （二） .大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備細菌轉化 儀器：旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭,微量離心管，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工 作臺，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫搖床，培養(yǎng)皿（已 鋪好固體LB-Amp）,酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，濾膜和過濾器 試劑：E.coli菌種，LB培養(yǎng)基，mol/LCaCl2溶液，無菌ddWater, LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加

10、抗菌素），無菌ddwater,IPTG, X-gal。 步驟（1）在超凈工作臺中，將1ml大腸桿菌菌液加入100mlLB液態(tài)培養(yǎng)基（不含 ，應該在950ml去離子水中加入：胰化蛋白月東10g酵母提取物 微量離心管，雙面離心 ddWater。 50ml微量離心管, 抗菌素），37c搖床培養(yǎng)過夜。 (2) 取上述菌液轉接到含有50mLLB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37c下250r/min 搖床培養(yǎng)23h,測定0口590為左右(,細胞數(shù)108/mL,此為關鍵參數(shù)！)。(注意：此步搖菌的時候，要有一管不加菌的LB培養(yǎng)液同時搖菌) (3) 將1ml菌液加入到4支預冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min,

11、 然后于4C,5000rpm離心5min。 (4) 將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml冰冷的mol/LCaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30mino (5) 4C,5000rpm離心5min,棄上清液后，用100dL冰冷的mol/LCaCl2溶液垂懸，插入冰中放置2h,可以直接用作轉化實驗，或立即放入-4攝氏度冰柜中保藏。 (6) 事先將恒溫水浴的溫度調到42o (7)從-70C超低溫冰柜中取出一管(100LL)感受態(tài)菌，立即用手指加溫融 化后插入冰上，冰浴510min。 (8)加入5dL連接好的質?；旌弦?DNA含量不超過100ng),輕輕震蕩后放 置冰上20min。 (

12、9) 輕輕搖勻后插入42c水浴中90s進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3min。 (10) 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入300科LLB培養(yǎng)基(不含抗菌素) 輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37c震蕩1h。 (11)在超凈工作臺中取上述轉化混合液200dL,分別滴到含合適抗菌素(Amp 100ug/L)的固體LB平板培養(yǎng)皿中，再在平板上滴加40dL20mg/mlX-gal,7L 200mg/mlIPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻(注意： 一個不含抗生素作為對照組， 玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂，菌液涂皿操作時，應避免反復來回涂布，因為感受態(tài)細菌的細胞壁有了變

13、化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉化率。)。 (12) 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記，先放置在37c恒溫培養(yǎng)箱中30min直到表 面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37C恒溫培養(yǎng)箱過夜。 (13) 在被細菌污染的桌面上噴灑70叱醇，擦干桌面。 (14) 觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。 (三).轉化克隆的篩選和鑒定 器材旋渦混合器，小鐐子，微量移液取樣器，移液器吸頭，微量離心管，雙 面離心管架，干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋)，制冰機，恒溫搖床，超凈工作臺，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。 試齊ILB培養(yǎng)基(加抗菌素)，PCR用試劑，引物，質粒提取用試劑，酶

14、切需要 的限制性內且酶及其緩沖液，65%甘油(65%甘油，LMgSO4,LTrisCl)。 操作步驟方法一：快速PCR篩選法 (1) 在轉化的平板培養(yǎng)基上隨機選取4個邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆 在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標記編號。 (2)在PCR微量離心管中配制25科l反應體系。 ddwater16科l 10 xPCRbuffer(不含MgCl2)科l 25mMMgCl2科l LdNTP2pl(每種dNTP終濃度) 10mol/LPrimer11科l(25pmoles) 10mol/Lprimer21科l(-25pmoles) 模板質粒用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，再伸入P

15、CR混合液中洗一洗 Taq酶(1l() 總體積25科l (2)根據(jù)廠商的操作手冊設置PCR儀的循環(huán)程序(本實驗室已經(jīng)設置為WZ: 94c5min94C1min60C1min72C1min50sgoto29times72c10min (2) PCR結束后， 取10l產物進行瓊脂糖凝膠電泳(與原始插入片斷同時比對)。 觀察膠上是否有預計的主要產物帶。 (3)按照編號找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。根據(jù)需要進行放大培養(yǎng)提取其質粒 (4)提取到的質粒與原先的空載體(或已知分子量的質粒)再對比電泳，以進一步確認。 方法二：提質粒再PCR或酶切鑒定 (1)在超凈工作臺中取3支無菌搖菌管，各加入3mLLB(含50mg/mL氨茉青霉 素)，用記號筆寫好編號。 (2)在超凈工作臺中將70%乙醇浸泡的小鐐子頭用酒精燈烤過，鐐取一支無菌牙 簽。用牙簽的尖部接觸轉化的平板培養(yǎng)基上的一個白色菌落，然后將牙簽放入盛有 3mLLB(含50mg/mL氨茉青霉素)的搖