《氨基酸薄層層析》ppt課件

1、如何分別鑒定氨基酸混合液？生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心氨基酸的薄層層析(Thin layer chromatography of amino acids)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握薄層層析法的普通原理。掌握薄層層析法的普通原理。 掌握氨基酸薄層層析法的根本操作技術(shù)。掌握氨基酸薄層層析法的根本操作技術(shù)。 掌握如何根據(jù)挪動速率掌握如何根據(jù)挪動速率RfRf值來鑒定值來鑒定 被分別的物質(zhì)即氨基酸混合液。被分別的物質(zhì)即氨基酸混合液。層析根本概念層析根本概念 層析技術(shù)是利用化合物中各組分的物理性質(zhì)層析技術(shù)是利用化合物中各組分的物理性質(zhì)如溶解度、吸附才干、分子外形和大小、分子

2、如溶解度、吸附才干、分子外形和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等的不同，使極性、分子親和力、分配系數(shù)等的不同，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度而最終從固定相上流過，不同組分以不同速度而最終被分別。被分別。 特點(diǎn)：分別效率高，能分別各種性質(zhì)相類似的特點(diǎn)：分別效率高，能分別各種性質(zhì)相類似的物質(zhì)。不僅可用于少量物質(zhì)的分別純化，也可物質(zhì)。不僅可用于少量物質(zhì)的分別純化，也可用于大量物質(zhì)的分別純化和制備。用于大量物質(zhì)的分別純化和制備。層析根本概念層析根本概念 固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。包括固定相：固定相是層析的一

3、個基質(zhì)。包括固體物質(zhì)如吸附劑，凝膠，離子交換劑固體物質(zhì)如吸附劑，凝膠，離子交換劑等和液體物質(zhì)如固定在硅膠或纖維素等和液體物質(zhì)如固定在硅膠或纖維素上的溶液，這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物上的溶液，這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)展可逆性的吸附、溶解和交換作用。進(jìn)展可逆性的吸附、溶解和交換作用。 流動相：在層析過程中，推進(jìn)固定相上待流動相：在層析過程中，推進(jìn)固定相上待分別的物質(zhì)挪動的液體、氣體等，都稱為分別的物質(zhì)挪動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中普通稱為洗脫劑，薄層流動相。柱層析中普通稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。層析時稱為展層劑。層析技術(shù)的分類層析技術(shù)的分類1按兩相所處形狀，可分為液相層析和氣相

4、層析按兩相所處形狀，可分為液相層析和氣相層析，前者以液體為流動相，后者以氣體為流動相。，前者以液體為流動相，后者以氣體為流動相。2按操作方式不同，可分為柱層析、薄層層析和按操作方式不同，可分為柱層析、薄層層析和紙層析。紙層析。3按層析的原理不同，可分為吸附層析、分配層按層析的原理不同，可分為吸附層析、分配層析、凝膠層析、離子交換層析和親和層析等。析、凝膠層析、離子交換層析和親和層析等。今天要做的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)原理屬于吸附層析，根據(jù)操作方式又屬于薄今天要做的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)原理屬于吸附層析，根據(jù)操作方式又屬于薄層層析，合到一同叫：吸附薄層層析。層層析，合到一同叫：吸附薄層層析。硅膠薄層層析硅膠薄層層析實(shí)驗(yàn)

5、原理實(shí)驗(yàn)原理 1.薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種 普通是將固體吸附劑涂布在平板上構(gòu)成薄層作為固定相。當(dāng)液相展開溶劑在固定相上流動時，由于吸附劑對不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的挪動速率也不同，因此可以彼此分開。即經(jīng)過吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復(fù)進(jìn)展，而將樣品各組分別分開來硅膠吸附薄層層析硅膠吸附薄層層析實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠 硅膠：表達(dá)式為硅膠：表達(dá)式為SiO2XH2OSiO2XH2O。層析用硅膠是一種。層析用硅膠是一種多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈構(gòu)造外表

6、上密布極多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈構(gòu)造外表上密布極性硅醇基性硅醇基Si SiOHOH，這種極性的硅醇基能和，這種極性的硅醇基能和許多化合物構(gòu)成氫鍵而產(chǎn)生吸附許多化合物構(gòu)成氫鍵而產(chǎn)生吸附. .實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)：硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)： 硅膠的吸附才干比氧化鋁稍弱，其吸附活硅膠的吸附才干比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。硅醇基顯較弱的酸性，因此，硅膠只能用硅醇基顯較弱的酸性，因此，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分別，堿性成分不能用它于中性、或酸性成分的分別，堿性成分不能用它分別。分別。硅膠的活化溫度通常為硅膠的活化溫度通常為10510511

7、0110，不，不能過高。能過高。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 2. 氨基酸與茚三酮的顯色反響 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它與氨基酸的羧基反響生成復(fù)原茚三酮、氨及醛，與此同時，復(fù)原茚三酮又與氨及茚三酮縮合生成紫紅化合物而使氨基酸斑點(diǎn)顯色。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理3. 3.混合氨基酸被分別后在薄層層析圖譜上的位置混合氨基酸被分別后在薄層層析圖譜上的位置用相對遷移率用相對遷移率RfRf值值rate of flowrate of flow來表示。來表示。 層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動方向遷移的間隔層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動方向遷移的間隔與溶液前沿的間隔之比為與溶液前沿的間隔之比為RfRf值。值。 由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是

8、一定由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故挪動速率的，故挪動速率RfRf值也是恒定的，因此可值也是恒定的，因此可以根據(jù)以根據(jù)RfRf值來鑒定被分別的物質(zhì)。值來鑒定被分別的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)資料實(shí)驗(yàn)資料 吸附劑：硅膠吸附劑：硅膠 粘合劑：粘合劑： 0.5% 0.5%的羧甲基纖維素鈉的羧甲基纖維素鈉 氨基酸的異丙醇溶液氨基酸的異丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展開展開- -顯色劑正丁醇、乙酸、茚三酮溶液顯色劑正丁醇、乙酸、茚三酮溶液 分析樣品：氨基酸混合液分析樣品：氨基酸混合液器器 材材 層析板、尺子、鉛筆層析板、尺子、鉛筆 燒杯、玻棒、量筒燒杯、玻棒、量筒 吹風(fēng)機(jī)吹風(fēng)機(jī) 毛細(xì)

9、管、層析缸毛細(xì)管、層析缸 藥匙藥匙 烘箱烘箱薄層層析安裝薄層層析安裝操作步驟操作步驟薄層板的制備薄層板的制備層析板制備層析板制備2cm1cm Ala Arg Gly Mix輕觸疾起輕觸疾起操作步驟操作步驟點(diǎn)樣點(diǎn)樣點(diǎn)樣操作點(diǎn)樣操作操作步驟操作步驟 展層、顯色展層、顯色Ala Arg Gly Mix試樣展開過程試樣展開過程結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算 Rf =斑點(diǎn)至原點(diǎn)間隔斑點(diǎn)至原點(diǎn)間隔溶劑前緣至原點(diǎn)間隔溶劑前緣至原點(diǎn)間隔 小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心間隔，再小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心間隔，再量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的間隔，計(jì)算出它量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的間隔，計(jì)算出它們的們的 值。值。 根據(jù)值，鑒定出混合樣品中氨基酸根據(jù)值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。的種類，并繪出層析圖譜。Rf值丈量值丈量數(shù)據(jù)處置數(shù)據(jù)處置樣品ArgGlyAla混合液斑點(diǎn)-原點(diǎn)溶劑前緣-原點(diǎn)Rf值本卷須知本卷須知1. 1.切勿用手直接接觸薄層板面。切勿用手直接接觸薄層板面。2. 2.點(diǎn)樣過程中必需在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。點(diǎn)樣過程中必需在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。3. 3.樣品量太少，有的成分不易顯示；