一種新的吡咯多胺鎳配合物的合成及其與DNA的作用研究

1、·研究論文·一種新的吡咯多胺鎳配合物的合成及其與 DNA 的作用研究鄒敏劉叔文周春瓊*(南方醫(yī)科大學藥學院 廣州 510515)摘要 合成了一種新的吡咯-多胺金屬鎳配合物, 并用質譜、核磁、紅外、摩爾電導、元素分析等多種手段分析了配體和配合物的結構; 紫外、熒光和黏度等方法分析了鎳配合物與小牛胸腺 DNA (CT DNA)的作用, 發(fā)現配合物以插入方 式與 DNA 結合; 電泳法研究發(fā)現配合物在反應溫度為 5055 間可將超螺旋 pBR 322 DNA 完全切割為缺刻產物; 細 胞水平抗腫瘤實驗表明該鎳配合物具有一定的抗肝癌活性.關鍵詞 吡咯; 多胺; 鎳配合物; DNA;

2、 抗肝癌活性Synthesis and Studies on DNA-binding of a New Nickel Complex withPyrrole and PolyamineZhou, Chunqiong*Zou, MinLiu, Shuwen(School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515)Abstract A new nickel complex of pyrrole-polyamine had been synthesized and its structure h

3、ad beencharacterized by MS, 1H NMR, IR, molar conductance and elementary analysis. CT DNA-binding of nickel complex had been investigated using UV spectra, fluorescent spectra and viscosity. The results have proved that the mode of binding of nickel complex to CT DNA is the intercalative mode. The c

4、omplex can com-pletely translate supercoil DNA into the nicked DNA between 50 and 55 . The complex has antitumor ac-tivity on HepG2, a liver tumor derived cell line.Keywords pyrrole; polyamine; nickel complex; DNA; antitumor activity得到重視, 有研究發(fā)現吡咯-多胺銅配合物4具有很好的 DNA 切割活性. 本文合成了一種新的多胺-吡咯鎳配 合物, 研究了配合物與 D

5、NA 的作用, 初步研究了鎳配合物的抗肝癌活性, 這對后期工作中設計更有效的人工 核酸酶及其抗腫瘤藥物提供了重要的研究基礎和參考價值.多胺化學核酸酶對新型腫瘤、抗艾滋病化學藥物的定向設計及其基因治療等方面均有重要意義和應用前 景, 其原因在于多胺類化合物能與多種分子配位, 不僅 能在體外與 DNA 特異性結合, 而且還能穿透細胞膜、 穿過核膜, 進入細胞核內抑制基因表達. 如杜俊等發(fā)現 的單取代大環(huán)多胺銅-鉑異核配合物具有較好的 DNA 切割活性1; 多胺類 Zn(II)配合物在 H2O2 存在下也能水 解斷裂 DNA2; 二水楊醛三乙基四胺鎂配合物可將超 螺旋 DNA 水解為線性產物3. 為

6、提高多胺化合物對 DNA 的特異選擇性, 將 DNA 識別體系吡咯、咪唑、吡 咯-咪唑等聚酰胺化合物與多胺類化合物結合, 合成特 異性識別 DNA 能力更高的人工核酸切割試劑的研究正1實驗部分1.1 試劑與儀器小牛胸腺 DNA, 購自華美生物工程公司; 溴化乙 錠(EB)購自舒伯韋公司; Hep G2 肝癌細胞株由南方醫(yī)科* E-mail: huagongzhoucq163 Received September 4, 2009; revised November 9, 2009; accepted November 26, 2009.廣東省自然科學基金(No. 7300452)資助項目.482

7、化 學 學 報Vol. 68, 20101.2.2鎳配合物的合成和表征將上述配體(0.3044 g, 0.667 mmol)溶于 25 mL DMF 溶液中, 將 NiSO46H2O (0.178 g, 0.667 mmol)溶于 10 mL 水中, 再將其在攪拌下加入配體溶液中, 室溫攪 20 h, 減壓蒸餾除去溶劑, 將殘渣用甲醇溶出, 濾液置于冰 箱中冷卻得到藍綠色固體, 過濾、水洗、干燥, 得到產 品 NiL. IR (KBr) : 3435.94 (OH), 3336.29 (OH),大學藥學院抗病毒研究中心保存; 其他試劑均為國產分析純試劑. PE-240C 元素分析儀; ZQ40

8、00 液相色譜-質譜 聯(lián)用儀; Shimadzu FTIR-8300 紅外光譜儀, KBr 壓片;Bruker Am-300 MHz 核磁共振儀; DDS-11A 電導率儀; TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計; RF-5301PC 熒光光譜儀 ; 烏 氏黏度計 ( 毛細管內 徑 0.5 0.6 mm); BECKMAN 34 pH 計; Tanon EPS300 電泳儀; Tanon HE-90 電泳槽; Alpha Hp 3400 熒光/可見數字圖像分析儀; GENios Pro TECAN 多功能酶標儀.1.2 配體和鎳配合物的合成及表征通過元素分析、質譜、核磁、紅外、熔點測定、摩

9、 爾電導等多種手段表征, 配體和配合物結構式4見圖 1.3268.10 (NH),1614.19 (CO),3124.79 (NH),1527.55 (CC),2957.21 (CH),1498.47 (CC), (CNO2, CN),1420.54 (NCH3, CN), 1311.181137.39 (CH2NH, CN), 1102.69 (CH2NH, CN),846.28 (CNO2, CN), 779.02 (NH), 750.28 (NH).FAB-MS: 639.1 (MH). Anal. calcd for C H N -18 30 8O12SNi: C 33.71, N 1

10、7.47, H 4.71; found C 33.65, N17.70, H 4.52. 比較配體與配合物的紅外光譜圖: 配合 物在 3435.94 和 3336.29 cm1 處出現了兩個羥基峰, 根據質譜和元素分析結果表明配合物中存在水分子, 再結 合電導率儀分析結果表明兩個水分子中的氧與 Ni 發(fā)生 配位, 形成 NiO 鍵; 配體中位于 3276.46 和 3137.79cm1 處有兩個不同位點的氨基的伸縮振動峰, 當形成 配合物之后均向低頻遷移至 3268.10 和 3124.70 cm1, 這表明金屬離子與氨基上的氮原子發(fā)生了配位; 配體中位于 1655.48 cm1 處的 CO

11、的伸縮振動峰在配合物中 向低頻遷移至 1614.19 cm1 處, 說明金屬離子與 CO 上的氧原子配位形成 NiO 鍵. 配制 1 mmol/L 的鎳配合物的水溶液, 其摩爾電導率為 205 Scm2mol1; 相同圖 1 配體及鎳配合物的結構式Figure 1 Structure of ligand and nickel complex1.2.1 配體的合成和表征參考文獻4方法合成了配體 N1,N8-二(1-甲基-4-硝 基吡咯-2-?；?三乙基四胺. m.p. 174176 , 與文 獻4基本吻合. 1H NMR (DMSO, 300 MHz), : 8.42 (t, J5.82 Hz,

12、 2H, H7), 8.20 (d, J1.60 Hz, 2H, H3), 7.40 (d, J1.96 Hz, 2H, H1), 3.85 (s, 6H, H4), 3.28 (t, J6.34Hz, 4H, H8), 2.65 (t, J6.33 Hz, 4H, H9), 2.58 (s, 4H, H11), 2.01 (t, J7.10 Hz, 2H, H10), IR (KBr) : 3276.46(NH), 3137.79 (NH), 2931.3 (CH), 2839.40 (CH), 1655.48 (CO), 1558.00 (NH), 1532.03 (CC),1500.64

13、 (CC), 1422.45 (NCH3, CN), 1310.92 (C NO2, CN), 1211.63 (CONH, CN), 1144.35 (CH2 NH, CN), 1107.02 (CH2NH, CN), 852.22 (C NO2, C N), 813.63 (N H), 751.12 (N H), 707.20濃度的 NiSO4 水溶液的摩爾電導率為 219 Scm2mol ,1由結果分析: 鎳配合物和鎳鹽的摩爾電導率值很接近,鎳鹽中的鎳離子與六個水分子配位形成的配合物, 內外 界陰陽離子個數比為 11, 因此多胺-吡咯鎳配合物內 外界陰陽離子個數比也為 11, 說明硫酸根

14、離子未與 金屬離子配位.1.3 鎳配合物與 CTDNA 作用的實驗方法1.3.1 吸收光譜實驗在參比池和樣品池中分別加入同樣體積的緩沖溶 液和配合物溶液, 配合物的濃度固定為 1.0 ×10 5 mol/L, 在 200400 nm 范圍內測定配合物的吸收光譜; 然后依次向參比池和樣品池中滴加相同體積(數微升)的 CT DNA 溶液, 同上方法測定吸收光譜.1.3.2 NiL 對 DNA-EB 熒光光譜的影響實驗固定 CT DNA 濃度為 4.05×105 mol/L, 加入一定 體積的 EB, 使 DNA 與 EB 的物質的量的比為 11, 然 后進行鎳配合物對 DNA-

15、EB 復合物的熒光強度的影響 實驗; 儀器條件為: 狹縫寬度: EXEm5 nm; 掃描速 度: 1500 nm/min; 激發(fā)波長: 520 nm; 發(fā)射譜范圍:(NO2), 597.54 (NO2). Anal. calcd forC18H26N8O6:C48.00, N 24.88, H 5.78; found C 47.96, N 28.92, H 5.82.FAB-MS: 473.0 (MNa).鄒敏等：一種新的吡咯多胺鎳配合物的合成及其與 DNA 的作用研究483No. 6540700 nm5.1.3.3 熒光 Scatchard 圖實驗CT DNA 的濃度固定不變, 以不同物質的

16、量濃度比c(NiL)/c(CT DNA)加入配合物, 室溫反應 1 h, 分別用100 µg/mL 的 EB 溶液進行滴定, 測量溶液的熒光強度. 儀器條件為: 激發(fā)波長: 520 nm, 狹縫寬度: EXEm10 nm, 發(fā)射譜范圍: 540700 nm. 由熒光數據算出 r 和 r/cf (r 為鍵合 EB 與總的核酸濃度的比值, cf 為游離的 EB 濃度), 根據 Scatchard 方程: r/cfk(nr), 以 r/cf 對 r 作 圖, 所得直線的斜率 k 即為 EB 與 DNA 的表觀結合常數, 由斜率和截距算出 n 即為每個核苷酸鍵合 EB 的位點 數6.1.3.

17、4 CT DNA 溶液黏度測定CT DNA 濃度固定為 1.4×104 mol/L, 金屬配合物 或 Ni2濃度依次增大, 溫度恒定在(25±0.1) , 反應半2結果與討論2.1 鎳配合物與 CT DNA 的作用2.1.1吸收光譜吸收光譜是研究配合物與 DNA 相互作用的比較直 接的一種方法. 當配合物與 DNA 以插入方式結合時, 通常發(fā)生減色效應, 并伴有一定程度的紅移, 減色效應 的程度通常與配合物和 DNA 作用的強弱有關; 當配合 物以其它模式與 DNA 作用時, 光譜的變化相對較小. 圖 2 為加入 CT DNA 前后鎳配合物的吸收光譜變化圖, 從圖中可以看出

18、, 隨著 DNA 的加入, 配合物的吸收峰 伴隨有減色現象, 其減色率可達到 18%, 表明配合物與 DNA 作用較強, 可能是以插入模式結合. 同時根據下列7,8:方程式計算了配合物與 DNA 的 結合常數 KbDNA/(a f) DNA/(b f) 1/Kb(b f), 式中 DNA表示 DNA 的濃度, , 和 分別代表 A/NiL、小時后, 進行測量, 以(/0)1/3 對 CNi/CDNA (NiL 或 Ni2a fbobsd自由鎳配合物的摩爾吸光系數和完全結合后的配合物的摩爾吸光系數, 以DNA/(af)對DNA作圖, 通過 直線的斜率和截距計算得到配合物與 DNA 的結合常數與

19、CT DNA 濃度的比值)作圖, 其中 代表出現配合物或Ni2時的黏度, 代表 CT DNA 單獨存在時的黏度, 測0試液的相對黏度計算公式 (tt0)/t0, 其中 t0 為緩沖液流經毛細管所需的時間, t 為 DNA 溶液(或含濃度不等的NiL-DNA 或 Ni2-DNA 溶液)流經毛細管所需的時間.1.4 鎳配合物與 pBR322 DNA 的電泳實驗用 5 mmol/L Tris-HCl (pH 7.50, 5 mmol/L NaCl)緩 沖溶液配制一定濃度的配合物溶液, 加入 0.7 µL 的 pBR322 DNA (0.5 µg/µL), 總體積為 20

20、 µL, 混勻后, 分 別在一定溫度下恒溫水浴反應 5 h, 通過加入 EDTA 和 溴酚藍終止反應, 然后瓊脂糖凝膠電泳分析配合物切割 DNA 的結果.1.5 MTT 實驗通過 MTT 法進行鎳配合物抗肝癌活性的體外篩選. 將肝癌細胞 HepG2 以 5×104 個/mL 接種于 96 孔板中, 每孔加 200 µL, 培養(yǎng)液為含 10%的 FBS, 5000 U/L 青霉 素、5000 U/L 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基. 在 37 , 5% CO2 的條件下培養(yǎng). 將合成的配合物溶解于 DMSO 中配成10 mmol/L 母液, 用培養(yǎng)液配成終濃度分別為 6

21、.3, 12.5,25, 50, 100, 200, 400, 800 µmol/L 的加藥培養(yǎng)基. 細胞在96 孔板中培養(yǎng) 24 h 后, 吸去上清, 換成各濃度的加藥培 養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng) 72 h. 棄培養(yǎng)基, 每孔加入 100 µL 含 0.5 mg/mL MTT 的培養(yǎng)液, 再孵育 3 h. 棄上清, 每孔加 100µL DMSO, 充分混勻, 在酶標儀上測 570 nm 處的吸光 值. 陽性對照藥物采用順鉑(Cisplatin) 和 5- 氟尿嘧啶 (5-FU). 實驗至少重復 2 次, 抑制率(%)(1T/C)×100%, 其中 T, C 分

22、別表示實驗孔和空白對照孔的吸光 值, 采用 CalcuSyn 軟件計算半數抑制濃度(IC50).51Kb 為 2.18×10 (Lmol ).圖 2 不同濃度 CT DNA 條件下 NiL 的作用的吸收光譜Figure 2 Absorption spectra of NiL in the presence of various concentration of CT DNA(1) c(DNA)/c(NiL)0; (2) c(DNA)/c(NiL)0.04; (3) c(DNA)/c(NiL)0.12;(4) c(DNA)/c(NiL)0.2; (5) c(DNA)/c(NiL)0.2

23、7484化 學 學 報Vol. 68, 20102.1.2NiL 對 DNA-EB 熒光光譜的影響圖 3 為配合物與 DNA-EB 體系作用的熒光光譜圖, 從圖 中可以看出 : 隨著配合 物濃度的不 斷增加 , DNA-EB 復合物的熒光明顯發(fā)生淬滅. EB 能專一性地插 入 DNA 雙螺旋或二螺旋內部的堿基對之間, 使熒光顯 著增強, 當 EB 從堿基對中被擠出來或雙螺旋減少時, 熒光發(fā)生淬滅, 因而可用作結構探針. 根據圖 3 說明配 合物與 DNA 在溶液中靠近時, 可能是吡咯環(huán)插入到 DNA 雙鏈之間而擠出一部分 EB, 從而導致熒光淬滅, 由此說明配合物可能是以插入方式與 DNA 結

24、合. 由于 導致熒光淬滅的原因較多, 是否確實是因為鎳配合物插 入 DNA 后而影響了 DNA-EB 體系的熒光淬滅, 還需用 熒光 Scatchard 圖作進一步地驗證.圖 4 不同濃度 NiL 條件下 EB 與 DNA 作用的熒光 scatchard圖Figure 4 Fluorescence satchard plots for binding of EB to DNAin the presence of various concentration NiL(1) c(NiL)/c(DNA)0; (2) c(NiL)/c(DNA) 0.025; (3) c(NiL)/c(DNA) 0.12

25、52.1.4粘度實驗粘度測定一般被認為是確定鍵合模式最有力的證 據之一, 粘度對分子長度變化非常敏感, 當小分子配合 物以插入模式與 DNA 作用時, DNA 相鄰堿基對的距離 會增大以容納插入的配體, 導致螺旋伸長, DNA 溶液的 粘度增加; 當配合物以靜電或溝面結合等非插入模式與 DNA 作用時, DNA 溶液的粘度無明顯變化; 而以部分 插入方式與 DNA 作用時, 則可能使 DNA 的雙螺旋扭NiL 的作用的圖 3 不同濃度 NiL 條件下 DNA-EB 復合物體系熒光發(fā)射光 譜Figure 3 Fluorescence emission spectra of DNA-EB comp

26、lex in various concentration of NiL(1) No NiL; (2) 1 µmol/L NiL; (3) 2 µmol/L NiL; (4) 5 mol/L NiL; (5) 10mol/L NiL; (6) 20 mol/L NiL; (7) 25 mol/L NiL7結, 使其分子粘度減小 . 從圖 5 可以看出, 鎳離子加入CT DNA 溶液中, 隨著離子濃度的增大, DNA 粘度值逐 漸減小, 可能是水合鎳離子物部分插入同時伴有靜電結合方式與 DNA 作用的結果; 鎳配合物加入 CT DNA 溶 液中, 隨著配合物濃度的增大, DNA

27、 粘度值逐漸增加,據此排除了配合物中可能殘留的金屬離子對 DNA 粘度 變化的影響, 由此可確定配合物是以插入方式與 DNA2.1.3熒光 Scatchard 圖熒光 Scatchard 圖是研究配合物與 DNA 作用方式的 一種非常重要的實驗方法, 參考文獻6, 以 r/cf 對 r 作 圖, 繪制出熒光 Scatchard 圖 4. 通常當藥物以插入方式 與 DNA 鍵合時, 藥物與 EB 對 DNA 上同一位點的結合 是競爭性的, 則 k 值變化, n 值不變; 當藥物以靜電方式 與 DNA 結合時, 藥物與 EB 對 DNA 上不同位點的結合 是非競爭性的, 則 n 值變化, k 值不

28、變; 當藥物與 DNA 的結合存在插入和非插入兩種方式時, k 和 n 都變化9. 從圖 4 可以看出, 隨著 DNA 溶液中配合物濃度的增大, k 值逐漸減小, 計算得到 n 值在 0.190 附近, 變化不大, 這說明配合物是以競爭方式來抑制 EB 與 DNA 的結合, 即配合物以插入方式與 DNA 結合.作用的,此結論與吸收光譜、熒光光譜實驗結果一致.圖5 NiL或Ni2對DNA黏度的影響Effect of NiL or Ni2 on the relative viscosity ofFigure 5DNA鄒 敏等：一種新的吡咯多胺鎳配合物的合成及其與 DNA 的作用研究485No. 6

29、2.2 鎳配合物與 pBR322 DNA 的作用瓊脂糖凝膠電泳研究了反應溫度在 3755 之間 配合物切割 pBR322 DNA 的情況如圖 6, 反應溫度超過55 的情況沒有顯示在圖中, 因 DNA 在該條件下將發(fā) 生熱變性而沉淀在膠孔中. 由電泳圖分析, 反應溫度低 于 50 時, DNA 切割效果不佳; 當反應溫度在 5055之間時 CCC 帶(超螺旋 DNA)可以完全切割為 OC 帶 (缺刻 DNA), 由此說明配合物切割 DNA 合適的反應溫 度范圍在 5055 之間. 在上述研究的基礎上, 進一步研究 50 時不同濃度配合物切割 pBR322 DNA 的情 況如圖 7, 發(fā)現隨著配

30、合物濃度的不斷增大, CCC 帶的 量逐漸減少, OC 帶的量逐漸增加, 當配合物濃度達到0.5 mmol/L 時, 可將大部分 CCC 帶切割為 OC 帶. 由此 說明配合物在較低的濃度下, 表現出較好的切割 DNA 的活性, 是一種較好的化學核酸酶.細胞的體外抑制活性. 與陽性對照藥物 Cisplatin 和 5FU對比, 配合物對 HepG2 肝癌細胞的體外抑制活性強于5FU, 而弱于 Cisplatin, 說明鎳配合物具有一定的抗肝 癌活性.圖 8 鎳配合物對 HepG2 肝癌細胞的體外活性Figure 8 Cytotoxicity against HepG2 liver-cancer

31、 cell of nickel complex表 1 藥物對 HepG2 肝癌細胞的 IC50 測定值Table 1IC50 measurementsof drugsagainstHepG2liver-cancer cellIC50Drug/(µmolL1)24 h48 h72 h圖 6 不同溫度下 NiL 對 pBR322 DNA 切割的瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 6 Agarose gel electrophoresis patterns for the cleavage of pBR322 DNA by NiL at various temperatureLane 1: DN

32、A 37 ; Lane 2: DNANiL 37 ; Lane 3: DNANiL 45 ;Lane 4: DNANiL 50 ; Lane 5: DNANiL 55 ; CCC: supercoiled; OC: nicked; cleavage condition: 0.60 mmol/L NiLNi-LCisplatin5FU32870.91040039028.8550020339.9540與陽性對照藥物對比,分析鎳配合物抗腫瘤活性的可能機理如下. 5FU 可抑制胸腺嘧啶核苷合成酶, 從而干擾 DNA 的生物合成, 還主要殺滅細胞增值周期中的 S 期, 但不是典型的細胞周期特異性藥物;

33、而 Cisplatin 在體內先將氯解離, 然后與 DNA 上的堿基共價結合, 形成雙鏈間的交叉聯(lián)接或單鏈內兩點的聯(lián)結而破壞 DNA 的結構和功能, 屬細胞周期非特異性藥物. 電泳實 驗表明鎳配合物可以使超螺旋 DNA 斷裂成缺刻產物, 從而直接破壞 DNA 的結構, 其作用機理可能類似于 Cisplatin, 屬細胞周期非特異性藥物. Cisplatin 是目前實 體腫瘤的一線治療藥物, 在腫瘤的化學治療上被廣泛使 用, 因此進一步優(yōu)化鎳配合物的結構, 將可能獲得更好 的抗腫瘤活性, 成為類似 Cisplatin 的抗腫瘤藥物, 用于 實體腫瘤的化學治療.圖 7 50 不同濃度 NiL 對

34、pBR322 DNA 切割的瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 7 Agarose gel electrophoresis patterns for the cleavage of pBR322 DNA by various temperature NiL at 50 Lane 1: no NiL; Lane 2: 0.05 mmol/L NiL; Lane 3: 0.10 mmol/L NiL; Lane 4:0.25 mmol/L NiL; Lane 5: 0.50 mmol/L NiL; CCC: supercoiled; OC: nicked2.3 配合物抗肝癌活性通過 MTT 法測定了不同

35、濃度的鎳配合物在不同的 作用時間下對 HepG2 肝癌細胞的抑制效果, 來確定配 合物的體外抗肝癌活性, 測定結果見圖 8 和表 1. 結果 顯示: 在低濃度時鎳配合物對 HepG2 肝癌細胞的增殖 沒有表現出明顯的抑制作用; 進一步增大配合物濃度, 體外抑制活性逐漸增強, 當藥物作用時間分別為 24, 48 和 72 h 時, 其 IC50 測定值分別為 328, 390 和 203 µmol/L, 說明恰當延長作用時間可以提高配合物對 HepG2 肝癌3結論合成了一種新的三乙基四胺-吡咯鎳金屬配合物,通過多種手段對其結構進行了表征. 紫外、熒光、黏度 等方法對其與 CT DNA 的作用方式進行了研究, 發(fā)現 CT DNA 的加入使配合物吸收光譜發(fā)生減色效應; 配合 物的加入導致EB-DNA 發(fā)生熒光淬滅; 隨著配合