兩性霉素B粗制品的結晶提純工藝研究

1、 Vol . 15, No . 12精細與專用化學品 第 15卷第 12期 Fine and Specialty Che m icals 2007年 6月 21日兩性霉素 B 粗制品的結晶提純工藝研究涂志英 31 陳麗輝 2 邵 偉 1(1. 三峽大學化學與生命科學學院 , 湖北 宜昌 443002; 2. 華東理工大學化學工程研究所 , 上海 200237摘 要 :以兩性霉素 B 粗制品為原料 , 以產(chǎn)品中未知雜質(zhì)含量 、 效價及質(zhì)量收率為考察對象 , 探索了兩性霉素 B 結晶的操作條件 。 實驗發(fā)現(xiàn) , 以 20%N , N 2二 甲基甲酰胺 2乙 醇 (75% 水溶液為溶劑體系 、 pH

2、 為 56、 75%乙醇 水溶液加入量為 34倍濾液體積時可得到雜質(zhì)含量低 、 。關鍵詞 :兩性霉素 B; 結晶 ; 提純 ; 效價Study on Adsorpti on 2of Am photer i c i n B 1L i 2hui 2, SHAO W ei 1istry L ife Science, Sanxia University, Yichang 443000, China;2. Che m ical Center, East China University of Science and Technol ogy, Shanghai 200237, China Abstract

3、:Taking the content of unknown 2i m purity in p r oduct, its potency and yield as the object f or investigati on, the crystallizati on p r ocess of amphotericin B was studied . The experi m ent results showed that the t otal content of the i m purities in a mphotericin B p r oduced by this p r ocess

4、 could be decreased, and its potency and yield was higher when the aqueous s o 2 luti on composed of 20%DMF2ethanol (75% was used as s olvent syste m and pH value was at the range of 56and the volu me of aqueous 75%ethanol s oluti on in 34ti m es as much as that of filtrate was added .Key words:amph

5、otericin B; crystallizati on; purificati on; potency 兩性霉素 B (Amphotericin B 是由結節(jié)鏈霉菌 (S. nodosus 產(chǎn)生的大分子多烯類抗真菌抗生素 1 , 它對念珠菌病 、 隱球菌病 、 組織胞漿菌病 、 球孢子菌 病 、 副球孢子菌病 、 青霉菌病等均有很強的抗菌活 性 , 為抗深部真菌感染的優(yōu)良藥物 , 目前尚無其他適 當?shù)目商娲?2 。雖然我國兩性霉素 B 原料藥的 生產(chǎn)已達到國際水平 , 市場需求年均增長率也已達 10%, 但因傳統(tǒng)純化工藝中仍存在諸多問題 , 特別是 未知雜質(zhì)含量高又難以去除 , 且回收率極

6、低 (到四 次精制收率 <10% , 這在很大程度上制約了其產(chǎn) 量 、 增加了其成本 。結晶是制備純物質(zhì)的有效方法 34 , 兩性霉素 B 現(xiàn)在常用的純化工藝主要是通過結晶方法進行 的 。 本研究以兩性霉素 B 粗制品為原料 , 以產(chǎn)品中 未知雜質(zhì) (以下稱 “ 有關物質(zhì) ” 含量 、 效價及質(zhì)量收 率為考察對象 , 對兩性霉素 B 結晶的基本操作條件 進行研究 , 以期為兩性霉素 B 結晶純化工藝的進一 步研究提供理論依據(jù) 。1 實驗材料兩性霉素 B 對照品和兩性霉素 B 原料 (粗制 品 均為上海新先鋒藥業(yè)有限公司產(chǎn)品 ; N , N 2二 甲 基甲酰胺 , 色譜純甲醇 HP LC,

7、 二甲亞砜 。2 實驗方法(1 溶解 精密稱取一定質(zhì)量的兩性霉素 B 原 料置于三口燒瓶中 , 按效價總億 1 10(總億 /v 加入 二甲基甲酰胺 (DMF , 室溫下攪成懸浮液 , 加入檸 檬酸 (m兩性霉素 B m檸檬酸=1 1185 , 并繼續(xù)攪拌使其 基本溶解 。83收稿日期 :2007204210 作者簡介 :涂志英 (19732 , 女 , 碩士 , 講師 , 從事生物分離工程研究 。 2007年 6月 21日 涂志英 , 等 :兩性霉素 B 粗制品的結晶提純工藝研究(2 活性炭吸附去熱源及脫色 加入溶液總體積 1%的 活 性 炭 (m /v (活 性 炭 須 經(jīng) 200烘 烤2

8、h , 攪拌約 15m in, 于鋪有硅藻土的布氏漏斗中過濾 , 濾掉活性炭及未溶物質(zhì) , 得濾液 。(3 結晶 在上述所得濾液中加入濾液一定體積倍數(shù)的適當?shù)幕旌先軇?, 攪拌 , 三乙胺乙醇水溶液調(diào)節(jié) pH 值到一定值 , 繼續(xù)攪拌 10m in 后 , 于 810 冷卻 6h, 抽濾 , 濾餅即為兩性霉素 B 產(chǎn)品濕品 。(4 干燥 將所得兩性霉素 B 濕品于 50 、 真空度 01060109MPa 下干燥 4h 以上 。3 實驗結果與討論考慮到兩性霉素 B 易溶于酸性 DMF, 不溶于水 、 低級醇 、 丙酮 、 乙酸乙酯 、 氯仿 、實驗選擇混合溶劑 20%DMF 2乙20%DMF

9、2甲 醇 (2丙 酮(75% B 產(chǎn)品效價 、 , 所得結果見表 1。表 1 溶劑體系對兩性霉素 B 產(chǎn)品的影響溶 劑 體 系產(chǎn)品效價/(u /mg有關物質(zhì)含量/%產(chǎn)品 收率 /%20%DMF2乙 醇 (75% 水溶液 996714851165 20%DMF2甲 醇 (75% 水溶液 1014913555105 20%DMF2丙 酮 (75% 水溶液 1014816157106由表 1數(shù) 據(jù) 可 以 看 出 , 以 20%DMF 2乙 醇 (75% 水溶液為溶劑體系所得產(chǎn)品的有關物質(zhì)含 量最低 , 產(chǎn)品純度最高 ; 20%DMF 2丙 酮 (75% 水溶 液與 20%DMF2甲 醇 (75%

10、水溶液所得產(chǎn)品效價相 近 , 都較 20%DMF2乙 醇 (75% 水溶液的稍高 , 但相 差很小 , 只有 1177%; 20%DMF 2丙 酮 (75% 水溶液 所得產(chǎn)品質(zhì)量收率較高 。從產(chǎn)品純度角度考慮 , 應 選用 20%DMF2乙 醇 (75% 水溶液為溶劑體系 。 3. 1 pH 值對兩性霉素 B 產(chǎn)品的影響兩性霉素 B 的結晶過程主要由兩步組成 , 首先 是兩性霉素 B 與檸檬酸反應生成易溶于 DMF 的兩 性霉素 B 檸檬酸鹽 , 然后加入 75%的乙醇水溶液降 低兩性霉素 B 的溶解度并調(diào)節(jié)溶液的 pH 值 , 使兩 性霉素 B 沉淀析出 。 由此可知 , pH 值是兩性霉素

11、 B 結晶純化過程中的一個重要操作參數(shù) 。 而且兩性霉 素 B 溶液不穩(wěn)定 , 易被酸堿所破壞 , 因此兩性霉素 B 結晶液的 pH 值必須控制在一定范圍內(nèi) 。若 pH 值 太高 , 兩性霉素 B 的內(nèi)酯環(huán)會被強堿所破壞 , 在結 晶過程中副產(chǎn)物又與兩性霉素 B 一同結晶析出 , 造 成產(chǎn)品純度下降 ; 相反 , 若 pH 值太低 , 未到兩性霉 素 B 的等電點處 , 則兩性霉素 B 沉淀不完全 , 最終 產(chǎn)品收率較低 , 會造成較大的經(jīng)濟損失 5 。以 20%DMF2乙 醇 (75% 水溶液為溶劑體系 , 調(diào)節(jié)溶液的 pH 值至 415、 515、 615、 715、 815左右 , 所

12、得結果見圖 1 。圖 1 pH 值對兩性霉素 B 產(chǎn)品的影響由圖 1可以看出 , 產(chǎn)品效價隨 pH 值的增大而 增大 , 在所考察的 pH 值范圍內(nèi) , pH 為 8152時效價 最高 , 此時的有關物質(zhì)含量也最低 , 說明在 415 pH 815時 , 增大 pH 值有利于產(chǎn)品純度及效價的提 高 ; 產(chǎn)品質(zhì)量收率在 pH 為 515時有最大值 , 這表明 兩性霉素 B 的等電點在 pH 為 515附近 , 調(diào)節(jié)溶液 的 pH 值到 515左右會有最大產(chǎn)品收率 。 建議將 pH 值控制在 56之間 , 在此范圍內(nèi) , 所得產(chǎn)品收率較 高 , 而且產(chǎn)品的 pH 值在 510左右 , 符合藥典酸度

13、項 下要求的 pH 值為 410610的規(guī)定 , pH 值低于 510或高于 610很容易造成產(chǎn)品酸度不合格 6 。3. 2 75%乙醇水溶液加入量對產(chǎn)品的影響溶劑用量是影響兩性霉素 B 產(chǎn)品純度和收率 的一個關鍵因素 。溶劑用量太少 , 兩性霉素 B 溶解 不完全 , 收率較低 , 而且雜質(zhì)溶解去除的也較少 , 產(chǎn) 品純度提高不大 ; 溶劑用量太大則成本太高 , 殘留在 母液中的兩性霉素 B 也會隨之增多 , 當母液量增大 到一定程度時 , 母液中殘留的兩性霉素 B 就會成為 影響產(chǎn)品收率的主導因素 , 此時增大溶劑用量 , 產(chǎn)品 收率會隨之降低 。為此 , 選擇一個最佳的溶劑用量 是有必要

14、的 。加入不同濾液體積倍數(shù)的乙醇水溶液 , 考察其 9 精細與專用化學品 第 15卷第 12期對產(chǎn)品效價 、 有關物質(zhì)含量及產(chǎn)品收率的影響 , 所得 結果見圖 2 。 圖 2 乙醇水溶液加入量對兩性霉素 B 產(chǎn)品的影響由圖 2可見 , 乙醇水溶液加入量為 4產(chǎn)品效價最高 ; 3講 , 乙醇水溶液加入量在 含量相差并不明顯 ; 范圍內(nèi) , 加 , 說明在乙醇水溶液加入量為 6倍濾液體積范圍 內(nèi) , 母液溶解的兩性霉素 B 不是收率的主要影響因 素 。 綜合考慮溶劑成本 、 產(chǎn)品純度及收率 3方面因 素 , 乙醇水溶液加入量在 34倍之間較為合適 。 采用結晶方法 、 以粗制品為原料 , 探索了兩

15、性霉 素 B 結晶的基本操作條件 , 實驗發(fā)現(xiàn) , 以 20%DMF2乙醇 (75% 水溶液為溶劑體系 、 pH 在 56、 75%乙 醇水溶液加入量為 34倍濾液體積時所得兩性霉 素 B 產(chǎn)品較為理想 , 這為兩性霉素 B 吸附結晶純化 工藝的進一步研究提供了重要的理論依據(jù) 。 參考文獻 1 顧覺奮 , 鄭珩 . 兩性霉素 B J . 國外醫(yī)藥抗生素分冊 , l996, 17:366 2, . 脂質(zhì)體的研制及其質(zhì)量評. , ( :5935953 . M . :科學出版社 , 19854, 王永莉 , 等 . 頭孢哌酮鈉結晶工藝的進展 J . 中國抗生素雜志 , 2004, 29(1 :586

16、2 5 鄭學麗 . 兩性霉素 B 粗粉回收工藝研究 J . 河北化工 , 2003, 6:1718 6 愈文和 , 楊紀根 . 抗生素工藝學 M . 沈陽 :遼寧科學技術出版社 , 1987 7 周立雪 , 周波 . 傳質(zhì)與分離技術 M . 北京 :化學工業(yè)出版社 ,2002(上接第 7頁 2. 5 精制 2. 5. 1 投料比32甲 基 242正 丁 酰 氨 基 252硝 基 苯 甲 酸 甲 酯 100kg; 甲醇 800kg 。 2. 5. 2 操作方法將甲醇加入精制釜 , 攪拌狀態(tài)下加入 32甲 基 242正丁酰氨基 252硝 基苯甲酸甲酯 100kg, 加熱至固體 全部溶解 , 冷卻有

17、結晶析出 , 于 20 時維持 015h 。 離心過濾 , 濾餅水洗至水清 , 于 60 下烘干 , 得 89kg 產(chǎn)品 , 收率 89%, 熔點為 151153 , HP LC 分析含 量 9810%。3 結果與討論各項工藝參數(shù)的確定如下 :(1 酯化 以硫酸為催化劑 (m 原料 m 硫酸 =2030 1 :甲醇分兩次加入 , 首先加 入部分 回流 6h (m 原料 m 甲醇 =1 67 , 蒸除甲醇和生成的水 , 然后 補加甲醇回流 5h (m 原料 m 甲醇 =1 415515 。(2 還原 酯化后的混合物不經(jīng)分離純化 , 直 接以 Pd /C為催化劑 (m 催化劑 m 原料 =118%

18、 , 以甲醇為溶劑 (m 甲醇 m 甲酯 =5 , 在 3050和 018110MPa 壓力條件下進行催化還原 。(3 縮合 以甲苯為溶劑 (m 甲苯 m 胺 =4 , 溫度為 90100 。(4 硝化 以 98%的硝酸和 98%的硫酸組成 的混酸為硝化劑 (其中硝酸的含量為 67% , 在較低 溫度 (515 條件下進行硝化 。在酯化 、 還原 、 縮合 、 硝化等各步完善的基礎上 , 反應所得的產(chǎn)物不經(jīng)分離純化可直接進行下步反 應 , 為降低生產(chǎn)成本打下了基礎 。 參考文獻 1 Uwe J R ies, Gerhard M ihm, Berthold Narr, et al . 62SubstitutedBenzi m idazoles as ne w nonpep tide angi otensin recep t or antago 2nist:synthesis, bi ol ogical activity, and structure 2activity relati on 2shi p s J . J Med Che m, 1993, 3