葉綠素的提取與含量測定

1、裝 訂 線實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱： 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn) 指導(dǎo)老師：成績：_實(shí)驗(yàn)名稱：葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)和葉綠素含量的測定實(shí)驗(yàn)類型：同組學(xué)生姓名：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填） 四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填） 六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填） 八、討論、心得一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅? 掌握植物中葉綠體色素的提取分離和性質(zhì)鑒定。2 掌握定量分析的原理和方法。二、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理：以青菜為材料，提取和分離葉綠體色素并進(jìn)行理化性質(zhì)測定和葉綠素含量分析。原理如下：1葉綠素和類胡蘿卜素均不溶于水而溶于有機(jī)溶劑，常用

2、95%的乙醇或80%的丙酮提取。2皂化反應(yīng)。葉綠素是二羧酸酯，與強(qiáng)堿反應(yīng)，形成綠色的可溶性葉綠素鹽，就可與有機(jī)溶劑中的類胡蘿卜素分開。3取代反應(yīng)。在酸性或加溫條件下，葉綠素卟啉環(huán)中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去鎂葉綠素和綠色的銅代葉綠素。 4葉綠素受光激發(fā)，可發(fā)出紅色熒光，反射光下可見紅色熒光。5定量分析。葉綠素吸收紅光和藍(lán)紫光，紅光區(qū)可用于定量分析，其中645和663用于定量葉綠素a,b及總量，而652可直接用于總量分析。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑材料：青菜葉 試劑：KOH固體、醋酸銅粉末、醋酸四、主要儀器設(shè)備：1天平（萬分之一）、可掃描分光光度計(jì)、離心機(jī)2研具、PE管、酒精燈等

3、五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）1定性分析：熒光現(xiàn)象：鮮葉3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成勻漿，過濾入三角瓶，觀察熒光現(xiàn)象皂化反應(yīng)： 加KOH數(shù)片劇烈搖均，加石油醚1ml和H2O 1ml，分層后觀察取代反應(yīng)：加醋酸約1ml，觀察顏色，取1/2加醋酸銅粉，加熱變亮綠色2葉綠素和類胡蘿卜素的吸收光譜測定：皂化反應(yīng)的上層黃色石油醚溶液（稀釋），在400-700nm處掃描光譜，分別測定類胡蘿卜素的吸收峰反復(fù)用石油醚粹取,直到無類胡蘿卜素,離心得葉綠素(鹽)，（稀釋），分別測定葉綠素的吸收峰3葉綠素定量分析：鮮葉，加2O，磨成勻漿，取2份0.2ml 加80%丙酮4.8ml,搖勻，4000轉(zhuǎn)離

4、心3min,上清液在645，652，663測定OD，計(jì)算Chla,Chlb 和Chl總量的值。六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1熒光現(xiàn)象：透射光綠色，反射光 紅光2皂化反應(yīng)：上層呈黃色，為類胡蘿卜素，吸收藍(lán)紫光。下層呈綠色。為葉綠素。吸收藍(lán)紫光和紅光。 皂化反應(yīng)分層3.類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測定：上層黃色溶液掃描光譜吸收峰為468nm、439nm、413nm、667nm和606nm五個(gè)下層綠色溶液掃描光譜吸收峰為414nm、526nm、639nm三個(gè)4取代反應(yīng)：加醋酸約1ml，變褐（去鎂葉綠素）取1/2加醋酸銅粉加熱變亮綠色，為銅代葉綠素。 去鎂葉綠素 銅代葉綠素波長/nm吸光度（第一組）吸光度（

5、第二組）645652663根據(jù)公式：Ca(mg/L)663-2.69 OD645Cb(mg/L)645-4.68 OD663CT(mg/L)=OD652Chla含量(mg/g.FW)= （Ca(mg/L)/1000）2/ 0.1 Chlb含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000）2/ 0.1 Chl總含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000）2/ 0.1 5/ 0.2 求得：Ca1= 1.899 mg/LCa2=1.965 mg/LCb1=0.790 mg/LCb2=0.853 mg/LCT1=mg/LCT2=mg/LChla含量1=Chla含量1 =Chlb含

6、量1 =Chlb含量 1=Chl總含量1=Chl總含量1=七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測定：類胡蘿卜素的吸收峰為藍(lán)紫光區(qū)468nm、439nm、413nm三個(gè)峰，在紅光區(qū)667nm和606nm的峰說明葉綠素有殘留。葉綠素在藍(lán)紫光區(qū)有414nm、526nm兩個(gè)峰，在紅光區(qū)有639nm一個(gè)峰，藍(lán)紫光區(qū)的峰比紅光區(qū)的高，說明葉綠素吸收藍(lán)紫光的能力比紅光強(qiáng)。葉綠素含量測定：Chla含量1 =Chla含量1 =Chlb含量 1 =Chlb含量 1=Chl總含量1=Chl總含量1=兩組測定結(jié)果中葉綠素a與葉綠素b含量之和與用663nm求得的總?cè)~綠素含量比較接近，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想，可能

7、造成實(shí)驗(yàn)誤差的因素有：1. 研磨后的葉綠素溶液中仍存在固體，可能堵塞移液槍管口，造成吸入的溶液量不準(zhǔn)確2. 比色皿未清洗干凈，造成測得的吸光度改變3. 分光光度計(jì)存在儀器誤差八、討論、心得思考題：1為什么葉綠素吸收紅光和藍(lán)紫紫光？葉綠素的能級(jí)有基態(tài)（G），第一單線激發(fā)態(tài)（E1），第二單線激發(fā)態(tài)（E2）和三線激發(fā)態(tài)（E3），光子吸收必須遵守普朗克定律，被吸收光子的能量必須等于基態(tài)和激發(fā)態(tài)的能量差。藍(lán)紫光能量大，可使葉綠素分子中的電子躍遷到E2，而紅光能量小，只能使其躍遷到E1，故葉綠素只能吸收藍(lán)紫光和紅光。2為什么可用皂化后的葉綠素鹽來測定葉綠素的吸收光譜？因?yàn)橛捎谌~綠素皂化反應(yīng)后的葉綠素鹽并不影響葉綠素分子的骨架結(jié)構(gòu)，葉綠素對(duì)光的吸收規(guī)律與葉綠素鹽對(duì)光的吸收規(guī)律幾乎是相同的，而且皂化反應(yīng)可以從葉綠體色素中只篩選出葉綠素，排除了其他色素的干擾，所以可用皂化后的葉綠素鹽來測定葉綠素的吸收光譜。討論：1. 皂化反應(yīng)后的黃色溶液需用石油醚萃取多次，如果萃取補(bǔ)充分，會(huì)有葉綠素殘留，在掃描吸收光譜時(shí)除了在468nm、439nm、413nm有吸收