葉綠素的提取與含量測定

1、裝 訂 線實驗報告課程名稱： 植物生理學實驗 指導老師：成績：_實驗名稱：葉綠體色素的提取、分離、理化性質和葉綠素含量的測定實驗類型：同組學生姓名：一、實驗目的和要求（必填）二、實驗內(nèi)容和原理（必填）三、實驗材料與試劑（必填） 四、實驗器材與儀器（必填）五、操作方法和實驗步驟（必填） 六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理七、實驗結果與分析（必填） 八、討論、心得一、 實驗目的和要求：1 掌握植物中葉綠體色素的提取分離和性質鑒定。2 掌握定量分析的原理和方法。二、 實驗內(nèi)容和原理：以青菜為材料，提取和分離葉綠體色素并進行理化性質測定和葉綠素含量分析。原理如下：1葉綠素和類胡蘿卜素均不溶于水而溶于有機溶劑，常用

2、95%的乙醇或80%的丙酮提取。2皂化反應。葉綠素是二羧酸酯，與強堿反應，形成綠色的可溶性葉綠素鹽，就可與有機溶劑中的類胡蘿卜素分開。3取代反應。在酸性或加溫條件下，葉綠素卟啉環(huán)中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去鎂葉綠素和綠色的銅代葉綠素。 4葉綠素受光激發(fā)，可發(fā)出紅色熒光，反射光下可見紅色熒光。5定量分析。葉綠素吸收紅光和藍紫光，紅光區(qū)可用于定量分析，其中645和663用于定量葉綠素a,b及總量，而652可直接用于總量分析。三、實驗材料與試劑材料：青菜葉 試劑：KOH固體、醋酸銅粉末、醋酸四、主要儀器設備：1天平（萬分之一）、可掃描分光光度計、離心機2研具、PE管、酒精燈等

3、五、操作方法和實驗步驟（必填）1定性分析：熒光現(xiàn)象：鮮葉3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成勻漿，過濾入三角瓶，觀察熒光現(xiàn)象皂化反應： 加KOH數(shù)片劇烈搖均，加石油醚1ml和H2O 1ml，分層后觀察取代反應：加醋酸約1ml，觀察顏色，取1/2加醋酸銅粉，加熱變亮綠色2葉綠素和類胡蘿卜素的吸收光譜測定：皂化反應的上層黃色石油醚溶液（稀釋），在400-700nm處掃描光譜，分別測定類胡蘿卜素的吸收峰反復用石油醚粹取,直到無類胡蘿卜素,離心得葉綠素(鹽)，（稀釋），分別測定葉綠素的吸收峰3葉綠素定量分析：鮮葉，加2O，磨成勻漿，取2份0.2ml 加80%丙酮4.8ml,搖勻，4000轉離

4、心3min,上清液在645，652，663測定OD，計算Chla,Chlb 和Chl總量的值。六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理1熒光現(xiàn)象：透射光綠色，反射光 紅光2皂化反應：上層呈黃色，為類胡蘿卜素，吸收藍紫光。下層呈綠色。為葉綠素。吸收藍紫光和紅光。 皂化反應分層3.類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測定：上層黃色溶液掃描光譜吸收峰為468nm、439nm、413nm、667nm和606nm五個下層綠色溶液掃描光譜吸收峰為414nm、526nm、639nm三個4取代反應：加醋酸約1ml，變褐（去鎂葉綠素）取1/2加醋酸銅粉加熱變亮綠色，為銅代葉綠素。 去鎂葉綠素 銅代葉綠素波長/nm吸光度（第一組）吸光度（

5、第二組）645652663根據(jù)公式：Ca(mg/L)663-2.69 OD645Cb(mg/L)645-4.68 OD663CT(mg/L)=OD652Chla含量(mg/g.FW)= （Ca(mg/L)/1000）2/ 0.1 Chlb含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000）2/ 0.1 Chl總含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000）2/ 0.1 5/ 0.2 求得：Ca1= 1.899 mg/LCa2=1.965 mg/LCb1=0.790 mg/LCb2=0.853 mg/LCT1=mg/LCT2=mg/LChla含量1=Chla含量1 =Chlb含

6、量1 =Chlb含量 1=Chl總含量1=Chl總含量1=七、實驗結果與分析類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測定：類胡蘿卜素的吸收峰為藍紫光區(qū)468nm、439nm、413nm三個峰，在紅光區(qū)667nm和606nm的峰說明葉綠素有殘留。葉綠素在藍紫光區(qū)有414nm、526nm兩個峰，在紅光區(qū)有639nm一個峰，藍紫光區(qū)的峰比紅光區(qū)的高，說明葉綠素吸收藍紫光的能力比紅光強。葉綠素含量測定：Chla含量1 =Chla含量1 =Chlb含量 1 =Chlb含量 1=Chl總含量1=Chl總含量1=兩組測定結果中葉綠素a與葉綠素b含量之和與用663nm求得的總葉綠素含量比較接近，說明實驗結果較為理想，可能

7、造成實驗誤差的因素有：1. 研磨后的葉綠素溶液中仍存在固體，可能堵塞移液槍管口，造成吸入的溶液量不準確2. 比色皿未清洗干凈，造成測得的吸光度改變3. 分光光度計存在儀器誤差八、討論、心得思考題：1為什么葉綠素吸收紅光和藍紫紫光？葉綠素的能級有基態(tài)（G），第一單線激發(fā)態(tài)（E1），第二單線激發(fā)態(tài)（E2）和三線激發(fā)態(tài)（E3），光子吸收必須遵守普朗克定律，被吸收光子的能量必須等于基態(tài)和激發(fā)態(tài)的能量差。藍紫光能量大，可使葉綠素分子中的電子躍遷到E2，而紅光能量小，只能使其躍遷到E1，故葉綠素只能吸收藍紫光和紅光。2為什么可用皂化后的葉綠素鹽來測定葉綠素的吸收光譜？因為由于葉綠素皂化反應后的葉綠素鹽并不影響葉綠素分子的骨架結構，葉綠素對光的吸收規(guī)律與葉綠素鹽對光的吸收規(guī)律幾乎是相同的，而且皂化反應可以從葉綠體色素中只篩選出葉綠素，排除了其他色素的干擾，所以可用皂化后的葉綠素鹽來測定葉綠素的吸收光譜。討論：1. 皂化反應后的黃色溶液需用石油醚萃取多次，如果萃取補充分，會有葉綠素殘留，在掃描吸收光譜時除了在468nm、439nm、413nm有吸收