木瓜蛋白酶提取實(shí)驗(yàn)方案

1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題目：木瓜蛋白酶的提取,純化分離及其生物學(xué)研究一、 實(shí)驗(yàn)原理：木瓜蛋白酶（papain）又稱木瓜酶，廣泛存在于番木瓜的根、莖、葉和果實(shí)，未成熟果實(shí)的乳汁中含量最豐富。是一種含疏基（-SH）肽鏈的內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力；同時(shí)還具有合成的功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質(zhì)。工業(yè)用的木瓜蛋白酶一般都是未經(jīng)純化的多酶體系?，F(xiàn)已知經(jīng)木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四種主要酶類：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶（papaya proteinase）、木瓜凝乳蛋白酶M（chy

2、mopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液為無色或淡黃色，有時(shí)呈乳白色；幾乎不溶于有機(jī)溶劑。它的最適pH值為5.7（一般39.5皆可），在中性或偏酸性時(shí)亦有作用；最適溫度為5560（一般1085皆可），耐熱性強(qiáng)，在90時(shí)也不會(huì)完全失活；受氧化劑抑制，還原性物質(zhì)激活。本實(shí)驗(yàn)主要采取有機(jī)溶劑沉淀法結(jié)合硫酸銨分級(jí)沉淀法來提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)溶解度的降低，另外，有機(jī)溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度差異而分

3、離的方法。有機(jī)溶劑分段沉淀法它常用于蛋白質(zhì)或酶的提純。使用的有機(jī)溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度有機(jī)溶劑易引起蛋白質(zhì)變性失活，操作必須在低溫下進(jìn)行，并在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以避免局部濃度過大。硫酸銨分級(jí)沉淀法：硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。鹽析時(shí)溶液PH在木瓜蛋白酶等電點(diǎn)時(shí)（PI=8.75）則效果最好，鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白

4、質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。木瓜蛋白酶活力測(cè)定：蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質(zhì)中的肽鍵，也能夠水解酰胺鍵和酯鍵，因此可用蛋白質(zhì)或人工合成的酰胺及酯類化合物作為底物來測(cè)定蛋白酶的活力。本實(shí)驗(yàn)選用酪蛋白為底物，測(cè)定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力。酪蛋白經(jīng)蛋白酶作用后，降解成相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸，在反應(yīng)混合物中加入三氯乙酸溶液，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和肽就沉淀下來，相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯乙酸溶液中的肽的數(shù)量正比于酶的數(shù)量和反應(yīng)時(shí)間。在280nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液吸光度的增加，就可計(jì)算酶的活力。酶活力單位定義：在規(guī)定條件下，1min內(nèi)酶水解酪蛋白釋放出相當(dāng)于1ug/ml酪氨

5、酸在275nm波長(zhǎng)處的吸收度為1個(gè)活力單位。以0.1mol/l鹽酸溶液做空白，在275nm波長(zhǎng)處測(cè)定空白溶液，待測(cè)定液，對(duì)照品溶液的吸光度。飽和硫酸銨溶解曲線：二、實(shí)驗(yàn)材料與儀器：材料：未成熟的番木瓜，無水乙醇，0.05mol/L磷酸氫二鈉; 0.1mol/L HC1，乙二胺四乙酸二鈉固體；氫氧化鈉固體，酪蛋白固體，半胱氨酸固體，氯化鈉固體，三氯乙酸固體，硫酸銨粉末，乙酸鈉固體，和冰乙酸溶液，EDTA。儀器：高速組織搗碎機(jī)，水浴箱，精確pH計(jì)，紫外分光光度計(jì)，高速冷凍離心機(jī)，精密電子天平，低溫冰箱。三、技術(shù)路線四、實(shí)驗(yàn)步驟4.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：所需試劑的配制以及考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)蛋白含量的預(yù)

6、實(shí)驗(yàn)，確保試驗(yàn)方法的可行性。考馬斯亮藍(lán)G-250染液（0.01%）：稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250固體粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取實(shí)驗(yàn)室無水乙醇47.5mL加2.5mL蒸餾水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸餾水定容至1000mL。靜置1h后，取棕色試劑瓶用乙醇清洗干凈用濾紙過濾溶液后封存。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（0.1mg/mL）:準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白0.01g用蒸餾水溶解并稀釋到100mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。酶保護(hù)劑：準(zhǔn)確稱量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，轉(zhuǎn)入棕色瓶中。5

7、00ml的2%(m/v)碳酸氫鈉和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：稱取10g的碳酸氫鈉和0.1871g的EDTA溶于500ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH至8.0。500ml的1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：稱取0.1871g的EDTA溶于500ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH至8.0。酪蛋白溶液：稱取酪蛋白0.6g加入0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液80mL（取1.433g磷酸氫二鈉固體加80mL蒸餾水即得溶液），置沸水浴中煮30min，時(shí)時(shí)攪拌，冷卻至室溫。加1M鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.00.1 。加蒸餾水稀釋到100mL。用前配置。酶稀釋液：A液 稱取半胱氨酸0.264g，氯化鈉1.

8、17g，加蒸餾水25mL溶解 ；B液 稱取乙二胺四乙酸二鈉0.112g，加蒸餾水10mL溶解；合并A、B液，攪拌均勻，用4.0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值到5.5，加蒸餾水稀釋至50mL 。用前配置。三氯乙酸溶液：取三氯乙酸0.9g，加乙酸鈉1.495g和冰乙酸0.95mL，加水溶解并稀釋至50mL。4.2木瓜蛋白酶提取4.2.1粗酶液提取：用薄的不銹鋼刀片沿未成熟的番木瓜的縱線將果皮割破，深度為23mm，根據(jù)果實(shí)大小的不同，每個(gè)果實(shí)可以510條刀口。將木瓜放于一個(gè)大燒杯中，使木瓜乳汁流入大燒杯中。收集10ml乳汁加入190ml蒸餾水水，勻速輕柔攪拌1h，得漿液。漿液用8層紗布進(jìn)行過濾,將

9、所得液分裝到離心管中，用離心機(jī)在3500r/min的條件下，離心15min。收集上清液至一潔凈的試管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20存取10ml酶原液（編號(hào)為酶液1）。4.2.2粗酶液純化：將粗液放入冰桶中，加入適量酶保護(hù)劑（0.04mol/L的半胱氨酸和0.004mol/L的EDTA），混勻后如下表加入試劑。酶液+保護(hù)劑（ml）硫酸銨粉末（至終濃度20%）（g）硫酸銨粉末（至終濃度的40%）（g）酶液+保護(hù)劑（ml）冷無水乙醇（65%）（ml）酶原液370+10148.6調(diào)節(jié)ph為6.0，4靜置過夜酶原液470+10置于冰桶中20靜置30min，離心4000r/min，30min，棄沉淀22靜

10、置30min，離心4000r/min，30min，取沉淀，加10ml蒸餾水取1ml酶液（酶液2），-20保存9+118.6對(duì)過夜的酶液繼續(xù)處理酶液+保護(hù)劑（ml）硫酸銨粉末（至終濃度20%）（g）硫酸銨粉末（至終濃度40%）（ml）酶原液34靜置過夜4000r/min 離心 30 min ,取沉淀，分別加加10ml蒸餾水取1ml酶液（酶液3），-20保存9+1置冰桶中2.5靜置30min,離心4000r/min,30min，棄沉淀2.7靜置30min,離心4000r/min,30min，取沉淀，加入10ml蒸餾水取1ml酶液（酶液4），-20保存透析袋處理取酶液并編號(hào)酶液6，-20保存酶原液4

11、編號(hào)酶液5，-20保存透析袋處理取酶液并編號(hào)酶液7，-20保存4.2.3透析：8000-14000標(biāo)號(hào)的透析袋處理：取透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度的小段。 放入大體積的2%(m/v)碳酸氫鈉和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸10分鐘。用蒸餾水徹底漂洗透析袋。放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將之煮沸10分鐘。冷卻后，存放于4度，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時(shí)起取用透析袋是必須戴手套，在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出，將之清洗干凈。系好透析袋的一端，從另一端注入酶液4、5，將透析袋放入蒸餾水中，在搖床上震蕩，時(shí)時(shí)換蒸餾水。直至向蒸餾水中加入氯化鋇溶液，無沉淀產(chǎn)生及透析

12、除鹽完成。取出蛋白質(zhì)溶液。60%乙醇透析膜處理40%硫酸銨45%飽和硫酸銨60%乙醇酶液1酶液3酶液4酶液2酶液5酶液6酶液7番木瓜透析膜處理4.3木瓜蛋白酶活性及總蛋白含量測(cè)定：4.3.1酶活性的測(cè)量酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液和酶液處理酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的制備：精密稱取酪氨酸0.005g用0.1mol/L鹽酸溶解并定容至100mL。（此為50ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)液）酶液的處理：取0.3ml酶液，加酶稀釋液2.7ml，稀釋至3mL。操作 待測(cè)液：準(zhǔn)確量取酶液溶液各1.0mL，分別置于2支10mL帶塞試管中，于50度水浴預(yù)熱5分鐘，準(zhǔn)確加入50度預(yù)熱的酪蛋白溶液5mL，立即振搖，置50度水浴中，精確反應(yīng)10min后，加

13、三氯乙酸溶液5.0mL，振搖，于50度水浴中放置40min，用干燥濾紙過濾，濾液在2h內(nèi)采用分光光度法以水為空白，在275nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。 空白對(duì)照液：再精確量取酶液1.0mL，置于10mL具塞試管中，于50度水浴預(yù)熱5min，準(zhǔn)確加入50度預(yù)熱的蒸餾水5ml, 置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL，振搖，于50度水浴中放置40min，用干燥濾紙過濾，濾液在2h內(nèi)采用分光光度法以水為空白，在275nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A0。 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液：另取酪氨酸對(duì)照溶液，以蒸餾水為空白，在275nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度An。酶活力單位定義為在測(cè)定條件下,每1 min生成1g/mL酪氨酸所需的酶量

14、。公式： 酶活力（U/g）= 式中:1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液每1中含酪氨酸的量,單位為微克();10反應(yīng)時(shí)間;11測(cè)定總體積;n待測(cè)液的稀釋倍數(shù);1000毫克與克的轉(zhuǎn)換倍數(shù)。在上述條件下,每分鐘水解酪蛋白生成1酪氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。4.3.2酶含量的測(cè)量：取8支15 mL試管，按下表加入試劑管號(hào)12345678蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）00.10.20.30.40.60.81.O蒸餾水（ml）1.00.90.80.70.60.40.20考馬斯亮藍(lán)（ml）4.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白質(zhì)含量（ug）0102030406080100A595將試管搖勻，放置2-3分鐘。用分光光度計(jì)比色測(cè)定吸光值A(chǔ)595nm。(注意應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成