人可溶性核因子κB受體活化因子配基(sRANKL)

1、人可溶性核因子B受體活化因子配基(sRANKL)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書產(chǎn)品編號：E0470hUSCNLIFE TM 本試劑盒僅供體外研究使用!預(yù)期應(yīng)用ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中人可溶性核因子B受體活化因子配基(sRANKL)含量。實驗原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗sRANKL抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗sRANKL抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的sRANKL呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定

2、吸光度（OD值），計算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為400 pg/ml，請先稀釋至200 pg/ml，再做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋)后，分別稀釋成200 pg/ml，100 pg/ml，50 pg/ml，25 pg/ml，12.5 pg/ml，6.25 pg/ml，3.12 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制100 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml (不要少于0.5ml

3、) 200 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。3. 樣品稀釋液：1×20ml。4. 檢測稀釋液A：1×10ml。5. 檢測稀釋液B：1×10ml。6. 檢測溶液A：1×120l（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100l/孔），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10l檢測溶液A加990l檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。7. 檢測溶液B：1×120l/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B

4、 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 11. 覆膜：5張12. 使用說明書：1份自備物品 1. 酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱） 2. 微量加液器及吸頭，EP管3. 蒸餾水或去離子水，全新濾紙 標(biāo)本的采集及保存 1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本

5、采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：以上標(biāo)本置4保存應(yīng)小于1周，-20或-80均應(yīng)密封保存，-20不應(yīng)超過1個月，-80不應(yīng)超過2個月；標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。操作步驟實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使

6、稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100l，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100l（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜, 37反應(yīng)60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400l/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。 4. 每孔

7、加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100l，酶標(biāo)板加上覆膜37反應(yīng)60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350l/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。6. 依序每孔加底物溶液90l，酶標(biāo)板加上覆膜37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50l，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)

8、行檢測。注：1. 試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。 實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。2. 加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時，第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）最好控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。3. 孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同

9、時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。4. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。5. 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請精確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10l），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作

10、液。6. 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。7. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數(shù)。洗板方法1. 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。2. 自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再

11、用到正式實驗過程中。特異性 本試劑盒可同時檢測重組或天然的人sRANKL，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。計算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 檢測范圍：3.12 pg/ml - 200 pg/ml最低檢測限：0.78 pg/ml說明 1. 只有全部使用USCNLIFETM試劑才能保證檢測效果，因為所有試劑都是有關(guān)聯(lián)的，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守USCNLIFETM試劑的試驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。2. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。3. 試劑盒保存：