抗血管內(nèi)皮生長因子多位點核酶的合成及其體外切割作用

1、抗血管內(nèi)皮生長因子多位點核酶的合成及其體外切割作用                                              

2、;      作者：谷仲平王耀程周勇安李謹革張濤陳農(nóng)安【關(guān)鍵詞】  內(nèi)皮生長因子Design and synthesis of vascular endothelial growth factor specific multi-site ribozyme and its cleaved activity in vitro【Abstract】 AIM: To design and synthesize a multisite ribozyme against VEGF165 and to investigate its cleaved

3、activity in vitro. METHODS:  Specific singlesite (Rz1, Rz2, Rz3) and multisite ribozymes (Rz123) against VEGF165 were designed by computer analysis of the secondary structure of the ribozyme and the target RNA flanking sequence around the cleavage sites. The transcriptional vector was construct

4、ed, which included the multisite ribozyme and 5, 3cis selfsplicing ribozymes. The cleavage activity of the multisite ribozyme on target RNA was observed. RESULTS:  The multisite ribozyme was released properly from the transcription of the selfsplicing vector with cleavage by 5,  3cis riboz

5、ymes. The multisite ribozyme cleaved the target RNA and increased the cleavage efficiency. The cleavage rate was (37±10)% (Rz1), (51±8)% (Rz2 ), (68±15)% (Rz3) and (88±11)% (Rz123), respectively. CONCLUSION:  The synthesized multisite ribozyme designed with computer can effe

6、ctively cleave target RNA.【Keywords】 endothelium,vascular; endothelial growth factors; RNA,catalytic; cleavage; in vitro【摘要】目的： 設(shè)計合成血管內(nèi)皮生長因子多位點核酶，探討其對靶RNA的切割作用.方法： 利用計算機輔助設(shè)計針對VEGF165的3個單位點核酶 (Rz1, Rz2, Rz3) 和聯(lián)合型多位點核酶 (Rz123)，構(gòu)建其自剪切轉(zhuǎn)錄載體，觀察多位點核酶對靶RNA的切割作用.結(jié)果： 構(gòu)建的多位點核酶自剪切轉(zhuǎn)錄載體在體外轉(zhuǎn)錄中，順式核酶發(fā)生了自身剪切，并釋放出正確的目

7、的核酶，多位點核酶可切割靶RNA，且效率高于單一核酶，其切割效率分別為 (37±10)% (Rz1), (51±8)% (Rz2 ), (68±15)% (Rz3) 和(88±11)% (Rz123).結(jié)論： 抗血管內(nèi)皮生長因子多位點核酶體外可聯(lián)合切割靶RNA，具有較高的生物活性.【關(guān)鍵詞】 內(nèi)皮，血管；內(nèi)皮生長因子；RNA，催化；切割；體外研究0引言腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管的生成.腫瘤細胞不僅通過血管從宿主獲得營養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物，而且通過腫瘤血管向宿主輸入大量腫瘤細胞，導(dǎo)致腫瘤的不斷生長和轉(zhuǎn)移.血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothel

8、ial growth factor，VEGF）具有促血管形成、增高血管通透性和促進內(nèi)皮細胞有絲分裂等多種功能，在腫瘤的生長轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性的作用.抑制和阻斷VEGF的表達，可以顯著抑制多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移.抗血管生成治療腫瘤具有高效低毒和不易產(chǎn)生耐藥性等特點，已成為當(dāng)今腫瘤研究的熱點1-3.核酶（ribozyme, Rz）是能夠序列特異性切割靶RNA的一類RNA分子，通過人工設(shè)計合成的特異性核酶分子即可阻斷有害基因的表達.錘頭狀核酶分子較小、結(jié)構(gòu)簡單、人工設(shè)計容易，且在靶RNA中出現(xiàn)率高，因而被廣泛用于基因治療的研究4.本研究選擇VEGF165 基因mRNA為靶分子，設(shè)計合成多位點錘頭狀核酶，構(gòu)

9、建核酶的自剪切轉(zhuǎn)錄載體，觀察多位點核酶對VEGF165 mRNA的切割作用.1材料和方法11計算機設(shè)計核酶采用中科院上海生化研究所陳農(nóng)安研究員編制的核酶設(shè)計軟件程序，確定VEGF165 mRNA上的核酶切點位置，根據(jù)Symons的錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)模型，設(shè)計核酶的切割活性中心及其兩側(cè)的結(jié)合序列5，并采用加拿大國家科學(xué)院Zuker編寫的pcFOLD軟件對靶mRNA切點兩翼堿基序列二級結(jié)構(gòu)進行分析預(yù)測，確定核酶的序列和切點位置.12質(zhì)粒、菌種及試劑質(zhì)粒pGEMRzHBV（含有5和3順式自剪切核酶）及宿主菌JM109由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院感染病科李謹革博士惠贈.pGEM3Zf（+）VEGF質(zhì)粒（含VEG

10、F165基因全序列）由美國哥倫比亞大學(xué)Abraham JA教授惠贈.IPTG、Xgal和限制性內(nèi)切酶購自華美公司，T4DNA連接酶和T7RNA聚合酶為Promega公司產(chǎn)品，質(zhì)粒純化試劑盒和轉(zhuǎn)錄試劑盒為Gibco公司產(chǎn)品， 32PUTP購自北京亞輝公司.13合成核酶3個核酶基因均由大連寶生物技術(shù)有限公司合成.合成的核酶經(jīng)T4多核苷酸激酶磷酸化、變性、退火，分別形成粘性末端（XbaI, Hind），（Hind, BamH）和（BamH, Aat）.14設(shè)計構(gòu)建核酶自剪切轉(zhuǎn)錄載體合成的3個核酶片段經(jīng)T4連接酶連接，得到帶有Xba和Aat黏性末端的片段.質(zhì)粒pGEMRzHBV的T7啟動子下游依次排列

11、有5 順式核酶、RzHBV和3 順式核酶.經(jīng)Xba和Aat雙酶切及10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用質(zhì)粒純化試劑盒回收.用T4DNA連接酶與上述核酶連接片段連接，構(gòu)成核酶自剪切轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pGEMRz123（Fig 1）.將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109菌，經(jīng)藍白篩選陽性克隆菌落，抽提質(zhì)粒，進行酶切分析和DNA測序鑒定.圖1pGEMRzVEGF質(zhì)粒的構(gòu)建略15核酶體外轉(zhuǎn)錄及對靶mRNA的切割核酶Rz123分別經(jīng)（Xba, Hind），（Hind,BamH）和（BamH, Aat）雙酶切得到Rz1，Rz2和Rz3.重組質(zhì)粒pGEMRz123和pGEM3Zf（+）VEGF經(jīng)內(nèi)切酶酶切線性化后，用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑

12、盒合成Rz123，Rz1，Rz2，Rz3和底物VEGF165 mRNA.將Rz123，Rz1，Rz2，Rz3和底物RNA按101比例混合，切割反應(yīng)體系為pH 76的75 mmol/L TrisHCl和6 mmol/L MgCl2，反應(yīng)體積為10 L反應(yīng)2 h后用終止液7 mmol/L Urea和20 mmol/L EDTA終止反應(yīng)， 60 g/L變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影確定切割條帶位置，激光圖像分析儀分析切割效率.以上每個反應(yīng)重復(fù)6次.統(tǒng)計學(xué)處理： 統(tǒng)計分析采用SPSS軟件進行方差分析，兩兩之間采用最小顯著差法.2結(jié)果21核酶的計算機設(shè)計根據(jù)計算機對其二級結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)VEGF16

13、5 mRNA上108，189和249 3個位點的二級結(jié)構(gòu)較為理想，分別將切割這3個點的核酶命名為Rz1，Rz2，Rz3.根據(jù)能量最低化原理預(yù)測核酶的切割效率為Rz1 百事通  圖2pGEMRzVEGF質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄略22核酶的合成按照計算機輔助設(shè)計的結(jié)果，分別合成了帶有黏性末端的Rz1，Rz2，Rz3基因，經(jīng)酶切和測序鑒定，結(jié)果和設(shè)計的預(yù)期序列完全一致.其堿基序列如下：23自剪切轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建及其體外轉(zhuǎn)錄pGEMRz123經(jīng)T7 RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物放射自顯影可見3個條帶，分別是Rz123（134 nt）、5 順式核酶（64 nt）和3 順式核酶（54 nt）（Fig 2）.這

14、表明設(shè)計合成的自剪切轉(zhuǎn)錄載體發(fā)生了5和3 順式核酶的自剪切，同時釋放出了目的核酶.pGEMRz123經(jīng)（Xba, Hind），（Hind, BamH）和（BamH, Aat）雙酶切，體外轉(zhuǎn)錄分別得到Rz1，Rz2和Rz3，經(jīng)測序分析結(jié)果正確.圖3核酶Rz1,Rz2,Rz3和Rz123對靶mRNA的切割作用略24核酶對靶RNA的切割作用Rz1，Rz2和Rz3分別將VEGF165 mRNA切割成110 nt和500 nt、190 nt和420 nt、250 nt和360 nt大小的兩個片段；Rz123與底物作用，除可得到Rz1，Rz2和Rz3單獨切割底物所見的上述片段外，還可共同作用產(chǎn)生80 nt

15、和100 nt的片段（Fig 3），同理論預(yù)測結(jié)果一致.對底物的切割效率分別為Rz1(37±10)%，Rz2(51±8)%，Rz3(68±15)%，Rz123(88±11)%，與計算機預(yù)測的一致.經(jīng)方差分析Rz123，Rz1，Rz2和Rz3的切割效率存在顯著差別（F=22.81，P=0000），Rz123高于單獨作用的核酶的切割效率(P<005)，Rz1，Rz2和Rz3的切割效率兩兩間比較具有顯著差異(P<005).3討論核酶由于具有諸多優(yōu)點，作為抗腫瘤基因治療的重要策略之一，已引起人們的重視.核酶切割靶RNA效率的高低主要取決于切點的選擇和

16、核酶的自身設(shè)計.理想的切點應(yīng)符合 位于靶基因的重要生物功能區(qū)，以使該基因被切割后其相應(yīng)的功能喪失. 靶點及其周圍序列具有高度保守性，使核酶的切割譜更廣泛. 靶點附近的二級結(jié)構(gòu)應(yīng)使核酶易于接近. 核酶兩側(cè)的無關(guān)附加序列應(yīng)較短6.然而，核酶切點的選擇、核酶催化活性中心及其兩側(cè)堿基序列長度的確立和核酶表達質(zhì)粒的設(shè)計，很大程度上依賴于研究者的經(jīng)驗.目前切點的選擇和核酶的設(shè)計有多種方法，計算機輔助設(shè)計核酶是一種常用、經(jīng)濟、方便和有效的方法，但它依賴于計算機軟件的功能.我們采用的軟件是經(jīng)過實踐不斷修改而成的.本研究利用此軟件設(shè)計合成的抗VEGF165多位點核酶，體外轉(zhuǎn)錄后能夠高效定點切割靶RNA，表明我們

17、的設(shè)計是正確的，計算機設(shè)計核酶是可靠有效的.核酶切割活性的發(fā)揮有賴于其空間結(jié)構(gòu)的正確性.由于目前使用的核酶載體在轉(zhuǎn)錄和導(dǎo)入細胞后產(chǎn)生的核酶，其兩側(cè)的長片段附加序列（載體堿基序列）會阻礙核酶與靶RNA結(jié)合，同時核酶發(fā)揮作用后不能很快與靶RNA解離，影響了核酶的切割效率，而且長片段附加序列的合成增加了細胞RNA的合成量，對細胞的正常代謝存在一定的影響.因此我們引入了5 cis和3 cis自剪切核酶，實驗結(jié)果證實有效地去除了附加序列對核酶活性的影響7,8.研究發(fā)現(xiàn)由于存在靶RNA分子基因堿基突變、空間結(jié)構(gòu)的多樣性以及核酶同細胞內(nèi)蛋白質(zhì)因子結(jié)合的可能性，從而使一些單一核酶喪失切割靶RNA的活性.因此僅

18、提高單一核酶的分子拷貝數(shù)，并不能有效地提高其在細胞內(nèi)的切割活性.而多位點核酶可在某個單一核酶不能切割靶分子時，其他核酶仍有機會切割靶RNA，從而使其失去生物功能.在本研究中，不僅抗VEGF165多位點核酶中的單一核酶能夠獨自發(fā)揮作用，而且能夠互相協(xié)同、互相促進而聯(lián)合發(fā)揮作用.說明多位點核酶比單一核酶更有效.利用核酶抗血管生成治療腫瘤具有廣闊的應(yīng)用前景.本研究采用多位點核酶可定點高效地切割VEGF165 mRNA，為細胞內(nèi)及在體應(yīng)用核酶抗腫瘤血管生成奠定了基礎(chǔ).【參考文獻】1 Gu ZP, Wang YJ, Li JG, et al. VEGF165 antisense RNA suppress

19、es oncogenic properties of human esophageal squamous cell carcinoma J. World J Gastroenterol, 2002;8(1):44-48. 2  Perrone G, Vincenzi B, Santini D, et al. Correlation of p53 and bcl2 expression with vascular endothelial growth factor (VEGF), microvessel density (MVD) and clinicopathological fea

20、tures in colon cancer. Cancer Lett,  2004 ;208(2):227-234.3 谷仲平. 血管內(nèi)皮生長因子與肺癌 J. 國外醫(yī)學(xué)外科學(xué)分冊, 2002;29(4):232234. Gu ZP. Vascular endothelial growth factor and lung cancer J. Foreign Med Sci Sect Surg, 2002;29(4):232-234.4 Song SI, Miller WA. Cis and trans requirements for rolling circle replication of a satellite RNA J. J Virol,  2004 ;78(6):3072-3082.5  陸長德, 陳農(nóng)安, 祁國榮. 核酶對靶RNA的體外切割反應(yīng)的計算機分析 J. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報,1996;28(3):279-285. Lu  CD, Chen NA, Qi GR. Computer analysis of the cleavage reaction of hammerhead