大孔吸附樹脂分離純化降香總黃酮的實(shí)驗(yàn)研究

1、大孔吸附樹脂分離純化降香總黃酮的實(shí)驗(yàn)研究     【摘要】  目的 考察大孔吸附樹脂分離純化降香總黃酮的工藝條件及參數(shù)。方法 選擇9種不同極性的大孔吸附樹脂，以降香總黃酮為指標(biāo)，通過靜態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)優(yōu)選樹脂，動態(tài)試驗(yàn)考察其純化降香總黃酮的最佳工藝條件。結(jié)果 靜態(tài)試驗(yàn)選出HPD100樹脂，其最佳靜態(tài)吸附時間和解吸附時間均為5 h，樣品溶液濃度為3.7 mg/mL，吸附流速為2 mL/min，10倍床體積的70%以上濃度乙醇洗脫，可解吸附70%的降香總黃酮。結(jié)論 HPD100樹脂能夠有效純化降香總黃酮。 【關(guān)鍵詞】  降香；總黃酮；大

2、孔吸附樹脂；分離純化  Abstract:Objective To study the purification process of total flavonoids in Lignum Dalbergiae odoriferae with macroporous resin. Methods 9 kinds of macroporous resins with different polarities were used in the purification of the total flavonoids in Lignum Dalbergia odorifera.R

3、esults  HPD100 macroporous resin was better in purification of the total flavonoids. The optimal static adsorbing time and desorbing time were both 5 h, the optimal concentration of sample was 3.7 mg/mL, flow speed was 2 mL/min, and eluted with ethanol at the concentration of more than 70% whic

4、h volume was ten times of elution bed volume, what was better in eluotropic effect with smaller in tailing level. Conclusion HPD100 macroporous resin could be used in the purification of the total flavonoids in Lignum Dalbergiae odoriferae. The adsorption quantity of total flavonoids at saturation w

5、as 24.983 mg/g。    Key words: Lignum Dalbergiae odoriferae; total flavonoids; macroporous resin; purification   降香Lignum Dalbergiae odoriferae為豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T.Chen的樹干和根的干燥心材1。降香中主要含有揮發(fā)油和黃酮類成分，以黃酮類成分的含量較高，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、中樞神經(jīng)作用及心血管方面的作用2。    大孔吸附樹脂具有良好

6、的吸附性能，應(yīng)用日趨廣泛，在天然藥物化學(xué)成分的分離與富集研究中被廣泛應(yīng)用3。本課題組對大孔樹脂純化降香總黃酮進(jìn)行了初步研究4，本實(shí)驗(yàn)選取文獻(xiàn)報道對分離黃酮類化合物作用較好的9種樹脂，考察其對降香總黃酮的吸附情況，優(yōu)選出最佳的精制工藝。    1  儀器與試藥    UV2450紫外可見分光光度儀（SHIMADZU）電子分析天平（BP211D）；降香藥材（廣州市藥公司，產(chǎn)地海南）；柚皮素對照品（實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)UV、1HNMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC檢測、面積歸一化法計(jì)算，純度大于98%）；HP20、HPD100、YWD01、NKA、

7、D140、NKA9、 DA201、 AB8、 S8等9種樹脂的生產(chǎn)廠家及主要參數(shù)見表1；化學(xué)試劑均為分析純。    2  方法與結(jié)果    2.1  樣品的提取及總黃酮含量測定方法    2.1.1  樣品溶液的制備  稱取50 g降香藥材粗粉，90 下用10倍量體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇提取 樹脂生產(chǎn)廠家極性平均孔徑/nm比表面積/(m2·g-1)HP20日本三菱化成非極性460600HPD100河北滄州寶恩化工有限公司非極性8.59.0650700YWD01

8、河北滄州遠(yuǎn)威化工有限公司非極性10500D140成都晨光化工研究院非極性9.5500600DA201華東理工大學(xué)華昌聚合物有限公司非極性90100450500AB8南開大學(xué)化工廠弱極性130140480520NKAII南開大學(xué)化工廠極性145155160200NKA9南開大學(xué)化工廠極性155165250290S8南開大學(xué)化工廠極性280300100120    2.1.2  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備  精密稱取柚皮素對照品0.001 43 g，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解并定容至50 mL備用。分別精密吸取對照品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、

9、4.00、5.00、6.00 mL于10 mL容量瓶內(nèi)，準(zhǔn)確加入1 mL甲醇鈉，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置40 min，在410 nm處測定其吸光度。計(jì)算得回歸方程為Y=3.2422X-0.0193，r=0.999 8，線性范圍是0.014 30.085 9 mg。    2.1.3  樣品中總黃酮含量的測定方法  精密吸取待測樣品溶液0.1 mL稀釋至5 mL，再吸取1 mL稀釋液于10 mL容量瓶，準(zhǔn)確加入1 mL甲醇鈉，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置40 min，在410 nm處測定其吸光度，代入回歸方程計(jì)

10、算總黃酮含量5。   2.2  樹脂的預(yù)處理   樹脂先用乙醇浸泡24 h，充分溶脹。濕法裝柱，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗柱至流出液加水不出現(xiàn)白色混濁，用水洗盡乙醇。再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的HCl溶液對樹脂柱進(jìn)行酸洗，用水洗至中性。然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaOH溶液堿洗，水洗至中性，即可。         2.3  樹脂類型的篩選    2.3.1  靜態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)  準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的樹脂2 g于具塞的磨口錐形瓶中，精密

11、加入總黃酮質(zhì)量濃度為3.937 mg/mL的降香提取液30 mL，室溫25 下振蕩(110 r/min) 吸附24 h至平衡，過濾，取0.1 mL按“2.1.3”項(xiàng)下測定其吸光度并計(jì)算總黃酮含量。將上述吸附已達(dá)飽和的各樹脂分別加入適量蒸餾水洗滌，再加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇30 mL進(jìn)行洗脫，室溫25 下振蕩(110 r/min) 24 h，測定洗脫液中總黃酮含量。按下列公式計(jì)算吸附和解吸附數(shù)據(jù)：    比吸附量(mg·g-1)=(C0-Ce)×V/m        

12、 比解吸量(mg·g-1)=C1V/m    解吸附率(%)=比解吸量/比吸附量×100%    其中，C0為起始濃度，Ce為平衡濃度，V為溶液體積，m為樹脂質(zhì)量，C1為解吸液濃度。    結(jié)果見表2。表2  大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附解吸試驗(yàn)結(jié)果    綜合各樹脂的吸附量和解吸率，選取HP20、HPD100、NKA9、AB8 4種樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸附的動力學(xué)曲線考察。    2.3.2  靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸

13、附動力學(xué)曲線  準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的各樹脂2 g于具塞的磨口錐形瓶中，精密加入黃酮質(zhì)量濃度為3.937 mg/mL的降香提取液30 mL，室溫25 下振蕩(110 r/min)進(jìn)行吸附，在0.5、1、2、3、4、5、12、18、24 h時吸取上清液，測定樣品中的總黃酮含量，計(jì)算在t時刻內(nèi)各樹脂對降香總黃酮的吸附量，以吸附量對t作圖，得到各樹脂的吸附動力學(xué)曲線，見圖1。    將吸附24 h后的樹脂過濾后用蒸餾水沖洗，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇30 mL進(jìn)行洗脫，室溫25 下振蕩(110 r/min)，在0.5、1、2、3、4、5、12、18、24 h時吸取上清

14、液，測定溶液中的總黃酮含量，計(jì)算在t時刻內(nèi)各樹脂的解吸量，以解吸量對t作圖，得到各樹脂的解吸動力學(xué)曲線，見圖2。    綜合各樹脂的靜態(tài)吸附和解吸附的動力學(xué)曲線，HPD100樹脂吸附量和解吸量較高，在5 h內(nèi)吸附和解吸附高于其他樹脂，故選用HPD100大孔吸附樹脂做進(jìn)一步考察。    2.4  HPD100樹脂的純化工藝參數(shù)選擇    考察上柱液的流速、黃酮濃度等因素對樹脂吸附性能的影響，確定最佳的吸附工藝條件。對已吸附樣品的樹脂用不同濃度的乙醇進(jìn)行動態(tài)解吸附實(shí)驗(yàn)，考察不同濃度乙醇對樹脂解吸附性

15、能的影響，測定每1倍床體積的解吸量，繪制動態(tài)解吸曲線。    2.4.1  藥液濃度對吸附量的影響  將降香黃酮提取液稀釋成不同質(zhì)量濃度，各取30 mL于具塞三角瓶中，各加入HPD100樹脂2 g，室溫25 下振蕩(110 r/min) 吸附5 h，過濾，取0.5 mL溶液定容至5 mL，再取0.1 mL按“2.1.3”項(xiàng)下測定其吸光度并計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果見表3。表3  不同藥液濃度對吸附量的影響從表3可知，在低濃度下，隨著降香提取液的濃度增加，樹脂吸附率增大；在質(zhì)量濃度為3.7 mg/mL時，樹脂具有最大吸附量；溶液濃度大于4.0

16、 mg/mL，樹脂吸附率反而下降。因此，降香黃酮提取液的初始濃度以3.74.0 mg/mL為宜。    2.4.2  流速對吸附量的影響  將吸附流速分別控制為2、4、6、8 mL/min進(jìn)行動態(tài)吸附，流速對吸附量的影響見表4。從表中可看出，降香提取液的流速是影響樹脂吸附性能的重要因素之一。當(dāng)流速超過2 mL/min時，樹脂的吸附量明顯下降。因此，控制流速2 mL/min較理想。表4  流速對吸附量的影響    2.4.3  洗脫劑濃度的影響  取吸附飽和的HPD100大孔樹脂(總黃酮

17、吸附量為24.983 mg/g)，選擇不同濃度的乙醇水溶液作為洗脫劑，考察其解吸率，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，體積分?jǐn)?shù)70%以上的乙醇水溶液解吸附效果較好，達(dá)到了將近70%的解吸率，當(dāng)解吸液的濃度達(dá)到95%時，降香黃酮的解吸率最高可達(dá)97.86%。表5  洗脫劑濃度對解吸率的影響    2.4.4  洗脫劑用量的影響  取吸附飽和的HPD100大孔樹脂(24.983 mg/g)，用不同醇濃度的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，分段收集每1倍床體積洗脫液，并測定其吸收度，以N倍床體積為橫坐標(biāo)，收集液中降香總黃酮的洗脫量為縱坐標(biāo)繪制樹脂解吸曲線，通過解吸曲

18、線確定洗脫劑乙醇用量，結(jié)果見圖3。由洗脫曲線可知，10倍床體積的洗脫液基本可以將降香黃酮洗脫下來，且已醇體積分?jǐn)?shù)為70%以上的洗脫液洗脫較完全，拖尾現(xiàn)象程度較輕，故應(yīng)用10倍床體積、體積分?jǐn)?shù)高于70%乙醇洗脫較好。    3  結(jié) 論    HPD100大孔吸附樹脂對降香總黃酮的吸附和解吸附有較好的效果，能夠有效的純化降香總黃酮。在本實(shí)驗(yàn)條件下，最佳靜態(tài)吸附時間和解吸附時間均為5 h，上柱樣品溶液質(zhì)量濃度為3.7 mg/mL，吸附流速為2 mL/min，體積分?jǐn)?shù)大于70%的乙醇溶液洗脫效果較好，洗脫的拖尾程度較小，吸附飽和時

19、降香總黃酮的吸附量為24.983 mg/g。    4  討 論    大孔吸附樹脂的性質(zhì)不同程度地影響著其分離純化效果。樹脂的極性（功能基）是影響吸附性能的重要因素6。本文選取極性、弱極性、非極性3種類型的樹脂為吸附材料，初步研究了樹脂對降香黃酮的吸附、解吸附特性。從表2可以看出，極性大的S8樹脂吸附量最大，這主要是由于黃酮類化合物具有酚羥基和糖苷鍵，具有一定的極性和親水性，根據(jù)相似相容原理，黃酮類化合物易被極性樹脂吸附。    但是，從試驗(yàn)結(jié)果來看，其精制效果并非極性越大越好，如極性大的S8

20、樹脂吸附量最大，但它的解吸率僅僅為36.87%，在所選材料中解吸率最低，這在生產(chǎn)中是極為不利的。樹脂的空間結(jié)構(gòu)（平均孔徑、比表面積）也是影響樹脂吸附效果的重要參數(shù)6，大孔樹脂吸附原理主要為物理吸附，所以比表面積越大，表面張力越大,吸附量越高，更有利于吸附。從表2可以看出，雖然NKAII、NKA9為極性樹脂，但其吸附量僅僅為5.552 mg/g、5.860 mg/g，在9種吸附材料中吸附量最小，而非極性的HPD100、D140卻具有較大的吸附量。這主要是由于NKAII、NKA9樹脂的比表面積遠(yuǎn)小于非極性的HPD100、D140樹脂，減弱了樹脂對黃酮類化合物的吸附能力，所以NKAII、NKA9樹脂并不適合于作降香黃酮的吸附劑。    大孔吸附樹脂的吸附過程主要是被吸附物通過樹脂孔徑進(jìn)入樹脂內(nèi)部