基于水溶性共軛聚合物的蛋白質(zhì)檢測(cè)_圖文

1、收稿:2009年5月*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.20574073,20601027資助*Corresp onding author e -mail:wangshu基于水溶性共軛聚合物的蛋白質(zhì)檢測(cè)*賀 芳 王 樹(shù)*(中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所有機(jī)固體重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100190摘 要 近年來(lái),共軛聚合物作為生物傳感元件,在生物大分子(如核酸、蛋白質(zhì)特異性識(shí)別和檢測(cè)方面的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。共軛聚合物具有強(qiáng)的光捕獲能力,具有倍增光學(xué)響應(yīng)性,可用來(lái)放大熒光傳感信號(hào),大大提高檢測(cè)的靈敏度,為生物傳感器的發(fā)展提供了新的傳感模式?；诠曹椌酆衔锏男滦蜕飩鞲衅髟卺t(yī)療診斷、環(huán)境檢測(cè)以及國(guó)家安全防御等方面具

2、有廣泛的應(yīng)用前景。本文簡(jiǎn)要介紹了共軛聚合物的熒光信號(hào)放大機(jī)制以及在蛋白質(zhì)、酶、抗原-抗體檢測(cè)方面的應(yīng)用。最后對(duì)共軛聚合物在蛋白質(zhì)檢測(cè)方面的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞 共軛聚合物 熒光信號(hào)放大 蛋白質(zhì)檢測(cè)中圖分類(lèi)號(hào):O644;O63;O629.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1005-281X(200911-2372-07Water -S oluble Conjugated Polymers for Protein DetectionsHe Fang Wang Shu*(Key Laboratory of Organic Solids,Institute of C he mistry,Chin

3、ese Academy of Sciences,Beijing 100190,C hinaAbstract Conjugated polymers (CPsare characterized by their delocalized electronic structures.The excitation energy along the whole backbone of CPs transferring to the reporter results in the amplified fluorescence signal,which makes them to be used as th

4、e optical platforms in highly sensitive chemical and biological sensors.This new technology is receiving more and more research and application interest due to the rapidly increasing demands of clinical diagnosis,environmental analysis and national defense.In this revie w,the mechanism of signal a m

5、plification of CPs and their applications in sensitive protein detection are introduced.Furthermore,the future researc h directions for protein detections based on CPs are also presented.Key words conjugated polymers;signal amplification;protein detectionContents1 Introduction2 Mechanism of signal a

6、mplification of CPs 2.1 Conformation transition mechanism 2.2 Fluorescent signal a mplification3 CPs for protein detections3.1 Protein detection based on conformation transition ofCPs 3.2 Protein detec tion based on fluorescent signala mplification of CPs 4 Conclusion and prospec ts1 引言自從1989年Roncal

7、i 等1,2第一次報(bào)道了利用共軛聚合物(CPs檢測(cè)Bu 4N +和Li +以來(lái),以聚乙炔、聚苯胺、聚噻吩、聚吡咯為代表的共軛聚合物已被廣泛用作化學(xué)傳感材料來(lái)探測(cè)金屬離子、氣體以及生物大分子(如蛋白質(zhì)與DNA3。這些共軛聚合物都具有很強(qiáng)的 - 共軛作用,電子或能量可在共第21卷第11期2009年11月化 學(xué) 進(jìn) 展PROGRESS I N C HE MISTRYVol.21No.11 Nov.,2009軛聚合物鏈中傳遞,這是共軛聚合物具有良好的電學(xué)、光學(xué)和電化學(xué)性能的主要原因。研究表明,共軛聚合物的這些性能可以通過(guò)化學(xué)合成進(jìn)行修飾,另外周?chē)h(huán)境如溫度、溶劑和pH值等都對(duì)它們有很大影響3 5。例如

8、通過(guò)在主鏈上連接側(cè)鏈可以得到水溶性的和易熔的聚合物,被取代的 -共軛聚合物還有熱致變色、溶劑化顯色、光致變色和壓電顯色等現(xiàn)象6 13,從而為制備新型的高靈敏度化學(xué)和生物傳感器帶來(lái)了希望,使共軛聚合物成為頗具應(yīng)用前景的高靈敏度傳感材料。早期的研究主要是利用聚乙炔的衍生物、聚吡咯或聚噻吩等的變色性能或電化學(xué)性能來(lái)檢測(cè)生物分子。最新的研究表明,利用共軛聚合物和被分析物間的電子或能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的熒光猝滅來(lái)檢測(cè)化學(xué)及生物分子比其他響應(yīng)信號(hào)(如分子吸收、電化學(xué)信號(hào)等更簡(jiǎn)便易行,而且共軛聚合物的強(qiáng)熒光信號(hào)放大效應(yīng)使之可以檢測(cè)出濃度很低的目標(biāo)分子信號(hào),大大提高了檢測(cè)靈敏度。本文主要介紹了共軛聚合物的熒光信號(hào)放大

9、機(jī)制以及在蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體和病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用。2 水溶性共軛聚合物的生物傳感機(jī)理利用共軛聚合物的熒光變化作為生物傳感信號(hào),主要有兩種方式:第一種是利用共軛聚合物隨著共軛鏈構(gòu)象的不同而表現(xiàn)出不同熒光性質(zhì)的機(jī)理;第二種是利用共軛聚合物通過(guò)能量或電子轉(zhuǎn)移而表現(xiàn)出的熒光增幅特性的機(jī)理。2.1 基于共軛聚合物構(gòu)象的傳感機(jī)理共軛聚合物構(gòu)象的變化會(huì)引起其光學(xué)性質(zhì)的變化,如吸收光譜、熒光光譜和熒光各向異性等。最典型的是聚噻吩,當(dāng)主鏈呈現(xiàn)非平面構(gòu)象時(shí),最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移,有較高的熒光量子產(chǎn)率。線(xiàn)性聚對(duì)苯撐乙烯(PPV和聚對(duì)苯撐乙炔(PPE共價(jià)連接烷基或烷氧基側(cè)鏈后,聚合物主鏈會(huì)彎曲成螺旋結(jié)構(gòu),它們的光學(xué)性

10、質(zhì)也隨之發(fā)生變化14 20。Schanze等15的研究表明螺旋型構(gòu)象和聚集態(tài)的產(chǎn)生使得聚合物的熒光被高效猝滅,原因是這種狀態(tài)下共軛聚合物的單線(xiàn)激發(fā)態(tài)能量更易于分散和傳遞。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)8共軛聚合物的構(gòu)象受到很多外在因素的影響,如熱、光、金屬離子、化學(xué)小分子以及生物大分子DNA與蛋白質(zhì)等均可誘導(dǎo)共軛聚合物構(gòu)象變化,從而改變聚合物的光學(xué)性質(zhì)。共軛聚合物的構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)樯锎蠓肿訖z測(cè)提供了新的傳感模式。2. 2 共軛聚合物的熒光信號(hào)放大傳感機(jī)制1995年Swager等21,22首次提出了共軛聚合物的熒光信號(hào)放大特性,實(shí)驗(yàn)證明其為共軛聚合物的 分子導(dǎo)線(xiàn) 機(jī)理。共軛聚合物共軛骨架允許電子或能量在整條鏈上自

11、由流動(dòng)。當(dāng)猝滅劑結(jié)合到鏈上的任何一個(gè)位點(diǎn)時(shí),就會(huì)阻礙整條鏈上的電子或能量流動(dòng),從而改變其熒光特性,即一個(gè)猝滅劑可能猝滅整條共軛聚合物鏈發(fā)出的熒光,這樣就產(chǎn)生了增強(qiáng)的電子或能量傳遞猝滅效果(圖1。共軛聚合物由于這些獨(dú)特的光電性質(zhì)而成為一類(lèi)新型的傳感材料,可作為化學(xué)和生物靶分子高度反應(yīng)性的光學(xué)傳導(dǎo)體,可用來(lái)放大熒光傳感信號(hào),為生物傳感器的發(fā)展提供了又一個(gè)新的傳感模式。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如果共軛聚合物的熒光性質(zhì)只受到相鄰環(huán)境的影響則不能產(chǎn)生信號(hào)放大效應(yīng)3,23 25。由于共軛聚合物的光譜能帶是由聚合物的重復(fù)單元數(shù)決定,如聚噻吩的重復(fù)單元數(shù)大于或等于7時(shí)它們的能帶相同,因此共軛聚合物的吸收光譜不能產(chǎn)生信號(hào)放大效

12、應(yīng)。熒光發(fā)射光譜由于受到電子或能量傳遞的影響呈現(xiàn)了指數(shù)的變化,只要有微小的相互作用就能使光譜發(fā)生較大改變。早期研究生物分子檢測(cè)主要是利用共軛聚合物構(gòu)象的變化引起紫外-可見(jiàn)吸收、氧化還原勢(shì)和傳導(dǎo)率等信號(hào)的變化,檢測(cè)靈敏度較低,通常為mmol或 mol級(jí)。相比于基于共軛聚合物構(gòu)象的傳感機(jī)理,利用共軛聚合物的熒光信號(hào)放大則能夠使檢測(cè)信號(hào)靈敏度提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。圖1 共軛聚合物的熒光信號(hào)放大機(jī)制22Fig.1 The mechanism of si gnal amplification of conjugated polymers22研究發(fā)現(xiàn)發(fā)光聚合物的熒光量子產(chǎn)率、聚集態(tài)以及猝滅劑的性質(zhì)影響聚合物的熒

13、光信號(hào)放大性能,進(jìn)而影響生物傳感器的靈敏度。Whitten等26發(fā)現(xiàn)陰離子聚對(duì)苯撐乙烯(MPS-PPV在陽(yáng)離子猝滅劑存在下雖然其熒光猝滅效率較高,但MPS-PPV本身的熒光量子產(chǎn)率較低,從而降低生物傳感器的靈敏2373第11期賀 芳等 基于水溶性共軛聚合物的蛋白質(zhì)檢測(cè)度。他們發(fā)現(xiàn)加入少量的表面活性劑十二烷基三甲基溴化銨(DTA可大大提高M(jìn)PS -PPV 的熒光量子產(chǎn)率,這是因?yàn)榫酆衔锏年庪x子和表面活性劑的陽(yáng)離子發(fā)生靜電相互作用,抑制了聚合物鏈的聚集以及熒光自猝滅從而提高了熒光量子產(chǎn)率。另外Tan 等27和Lavigne 等28對(duì)于提高量子產(chǎn)率也做了一些嘗試,他們?cè)O(shè)計(jì)了一種新的陰離子聚合電解質(zhì)P

14、PE -SO -3,它的熒光性質(zhì)隨著溶劑的組成不同呈現(xiàn)較大的變化。在水溶液中PPE -SO -3大部分以聚集狀態(tài)存在,其量子產(chǎn)率為0 10,而在甲醇溶液中其量子產(chǎn)率為0 78。在甲醇溶液中PPE -SO 3-被陽(yáng)離子猝滅劑猝滅的Stern -Volmer 猝滅常數(shù)(K sv 值與在水溶液中相比大大提高。最近,Fan 等29發(fā)現(xiàn)用納米金粒子猝滅陽(yáng)離子聚芴的K sv 值可達(dá)1011M -1,是目前報(bào)道的最高熒光猝滅效率。3 基于水溶性共軛聚合物的蛋白質(zhì)檢測(cè)3.1 基于共軛聚合物構(gòu)象傳感機(jī)理的蛋白質(zhì)檢測(cè)聚噻吩隨著共軛鏈構(gòu)象的不同而表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì),最近Leclerc 等30利用陽(yáng)離子聚噻吩衍生物

15、(聚3-烷氧基-4-甲基噻吩(1,實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血酶的靈敏檢測(cè)。陽(yáng)離子聚噻吩在ss -DNA(X1,5 -GGT -TGGTGTGGTTGG -3 存在下其吸收光譜在527nm 呈現(xiàn)最大吸收峰,但當(dāng)加入鉀離子時(shí)其最大吸收峰藍(lán)移至502nm,這是因?yàn)樵阝涬x子作用下單鏈DNA X1形成穩(wěn)定的G -四鏈體結(jié)構(gòu),從而使陽(yáng)離子聚噻吩卷曲成折疊的構(gòu)象,共軛主鏈的折疊導(dǎo)致有效共軛長(zhǎng)度的下降從而導(dǎo)致了吸收光譜的藍(lán)移。在人 -凝血酶存在下,因其與X1的特異性相互作用,使得X1同樣以G -四鏈體結(jié)構(gòu)存在,陽(yáng)離子聚噻吩的紫外吸收光譜與鉀離子存在下的吸收光譜幾乎相同。通過(guò)檢測(cè)聚噻吩的吸收光譜變化可以檢測(cè)到1 10-11m

16、ol 的 -凝血酶。另外通過(guò)檢測(cè)陽(yáng)離子聚噻吩的熒光性質(zhì)變化同樣可以檢測(cè) -凝血酶。當(dāng)X1 聚噻吩形成二元復(fù)合物時(shí),聚噻吩主鏈不發(fā)生折疊,聚噻吩的熒光被高效猝滅。向上述二元體系中加入 -凝血酶后形成 -凝血酶 X1 聚噻吩三元復(fù)合物,在該體系中X1以G -四鏈體構(gòu)象方式存在,由于聚噻吩主鏈的折疊,其非平面構(gòu)型使得分子間的聚集程度降低,其熒光信號(hào)恢復(fù)。因此通過(guò)檢測(cè)聚噻吩熒光強(qiáng)度的升高可實(shí)現(xiàn)對(duì) -凝血酶的檢測(cè),另外利用熒光特性可大大提高檢測(cè)靈敏度,其檢測(cè)限可達(dá)2 10-15mol 。核酸酶作用下的DNA 水解在DNA 復(fù)制與修復(fù)生物過(guò)程中起著重要作用。我們課題組31利用上述陽(yáng)離子型聚噻吩衍生物發(fā)展了

17、一種新型的無(wú)標(biāo)記、肉眼可視檢測(cè)核酸酶的傳感體系。陽(yáng)離子型聚噻吩與ssDNA 通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物,呈高度共軛和共平面的構(gòu)象;當(dāng)ssDNA 被非限制性?xún)?nèi)切酶S1水解成DNA 碎片后,聚噻吩與ssDNA 形成的復(fù)合物被破壞,聚噻吩轉(zhuǎn)變到非平面構(gòu)象。根據(jù)水溶液中聚噻吩由紫紅色到黃色的顏色變化,可以實(shí)現(xiàn)非限制性?xún)?nèi)切酶S1的檢測(cè)。Ingan s 研究小組在利用聚合物的構(gòu)象變化檢測(cè)蛋白質(zhì)上做了系列工作,他們利用氨基酸取代的聚噻吩在不同的酸堿溶液中呈現(xiàn)不同電荷密度的特性,通過(guò)目標(biāo)分子誘導(dǎo)其構(gòu)象變化的不同,設(shè)計(jì)了幾種生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)JR2E 和JR2K 32、鈣調(diào)蛋白33、淀粉狀纖維34等的檢測(cè)

18、。3.2 基于共軛聚合物熒光信號(hào)放大機(jī)理的蛋白質(zhì)檢測(cè)3.2.1 親和素(avidin和鏈霉親和素(streptavidin的檢測(cè)Whitten 等35發(fā)現(xiàn),水溶性的磺酸基衍生化的陰離子聚對(duì)苯撐乙烯(MPS -PPV能被陽(yáng)離子甲基紫(MV 2+高效猝滅,其Stern -Volmer 猝滅常數(shù)K sv 可達(dá)到107M -1,而相應(yīng)的單體熒光分子被MV 2+猝滅的K sv 僅為15M-1。帶有負(fù)電荷的MPS -PPV 很容易與帶有正電荷的MV 2+通過(guò)靜電相互作用結(jié)合,拉近它們之間的距離,進(jìn)而通過(guò)電子轉(zhuǎn)移作用使MPS -PPV 熒光被猝滅。基于這一發(fā)現(xiàn),他們首次利用共軛聚合物熒光放大的性質(zhì)設(shè)計(jì)了蛋白

19、質(zhì)傳感器。他們將甲基紫(MV 2+通過(guò)化學(xué)鍵連接到生物素分子(biotin上獲得B -MV2+(quencher -tether -ligand,QTL探針?lè)肿?biotin 和生物素結(jié)合蛋白(avidin有極強(qiáng)的特異性相互作用,它們之間的復(fù)合常數(shù)可達(dá)1015M -1。這種avidin 蛋白質(zhì)傳感器的工作原理如圖2所示:向MPS -PPV 的溶液中加入B -MV2+后,MPS -PPV 熒光被高效猝滅,向該體系中加入avidin 后,因avidin 與B -MV 2+的特異性結(jié)合使B -MV 2+遠(yuǎn)離MPS -PPV,MPS -PPV 熒光得到了恢復(fù)。因此通過(guò)檢測(cè)MPS -PPV 熒光強(qiáng)度的變

20、化,可實(shí)現(xiàn)對(duì)親和素avidin2374 化 學(xué) 進(jìn) 展第21卷的靈敏檢測(cè)。對(duì)比于熒光小分子,其檢測(cè)靈敏度可提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。Whitten 研究組36還發(fā)現(xiàn)這種基于QTL 方法的蛋白質(zhì)檢測(cè)在固相介質(zhì)上也可以實(shí)現(xiàn),為發(fā)展基于共軛聚合物的固相生物傳感器以及 生物芯片提供了依據(jù)。圖2 基于共軛聚合物的親和素檢測(cè)原理圖35Fig.2 Schematic representation of avidin detection based on water -soluble conjugated polymer35Cao 等37利用陰離子聚合物與抗生素蛋白之間這種非特異性相互作用發(fā)展了一種新的生物傳感系統(tǒng)。我

21、們實(shí)驗(yàn)室38設(shè)計(jì)并合成了帶有正電荷的水溶性聚芴衍生物PFP -NMe 3+以及帶有負(fù)電荷的熒光探針F1-B,利用熒光比值法,發(fā)展了高選擇性檢測(cè)中性的鏈霉親和素(streptavidin的體系。如圖3所示,F1-B 為一端帶有biotin 分子另一端連有負(fù)電荷的染料熒光素的分子探針,PFP -NMe 3+與F1-B 之間強(qiáng)的靜電相互作用可以導(dǎo)致向聚合物加入F1-B 時(shí)可以檢測(cè)到很強(qiáng)的FRET 。但是當(dāng)向探針F1-B 溶液中加入鏈霉親和素時(shí)因?yàn)樯锼睾椭行枣溍褂H和素具有很強(qiáng)的特異相互作用,探針的生物素端迅速結(jié)合到鏈霉親和素表面,而熒光素端則被埋入到空的結(jié)合位點(diǎn)中,加入聚合物后不能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。我們

22、的方法消除了非特異性相互作用,進(jìn)一步優(yōu)化了共軛聚合物在蛋白質(zhì)檢測(cè)上的應(yīng)用。3.2.2 細(xì)胞色素c(c yt c的檢測(cè)Heeger 等39發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)細(xì)胞色素c (cyt c可通過(guò)電子轉(zhuǎn)移的方式高效猝滅MPS -PPV,K sv 值可達(dá)108M-1。Cyt c 是一種含有血紅素的蛋白質(zhì),它對(duì)線(xiàn)粒體的呼吸鏈起至關(guān)重要的作用40,該蛋白質(zhì)含有Fe 3+,可有效猝滅MPS -PPV 的熒光。可能的猝滅機(jī)制如下:(1MPS -PPV MPS -PPV *(光照激發(fā)(2MB L -PPV *+cyt c(Fe 3+ MB L -PPV+cyt c (Fe 2+通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值,可以改變蛋白質(zhì)的表面電荷密度,

23、MPS -PPV 的Stern -Volmer 猝滅常數(shù)K sv 可以有6個(gè)數(shù)量級(jí)的變化。這一研究為蛋白質(zhì)檢測(cè)提供了 一個(gè)新的體系。圖3 基于共軛聚合物的鏈霉親和素檢測(cè)原理圖37Fig.3 Schematic representation of streptavidin detection based on water -soluble conjugated polymer 373.2.3 蛋白酶與蛋白激酶的檢測(cè)蛋白酶的研究在生理學(xué)和病理學(xué)領(lǐng)域都有著重要的意義,蛋白酶抑制物的篩選在新藥開(kāi)發(fā)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用41。在經(jīng)典的蛋白酶抑制物篩選方法中,紫外吸收和熒光的方法已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用,但這些方

24、法的靈敏度都只能達(dá)到mmol 或 mol 級(jí)42。Schanze 等43通過(guò)熒光 turn -on 和 turn -off的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白酶(protease的高靈敏檢測(cè)?；撬峄约棒然揎椀木蹖?duì)苯撐乙炔PPE -SO 3-和PPE -C O -2能被帶正電荷的小分子受體高效猝滅。將連有對(duì)硝基苯胺(p -NA的陽(yáng)離子多肽(酶底物和PPE -SO 3-結(jié)合后,p -NA 能將PPE -SO 3-高效猝滅,其靈敏度可達(dá)到nmol 的范圍。將一種水解酶(proteolytic enzyme加入到PPE -SO 3-和p -NA 核酸的混合液中后,水解酶使p -NA 水解從而使PPE -SO 3-的

25、熒光恢復(fù),這就是 turn -on 的過(guò)程;相比于熒光小分子,這種方法的檢測(cè)靈敏度可以提高2個(gè)以上的數(shù)量級(jí),而且可以對(duì)反應(yīng)的過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。 turn -off 的方法機(jī)理如下:Rho -Arg -2是一種無(wú)色且沒(méi)有熒光的小分子,它不能猝滅PPE -CO 2-,PPE -CO 2-和Rho -Arg -2的混合物有很強(qiáng)的熒光;將蛋白酶加入后由于蛋白酶對(duì)Rho -Arg -2作用使Rho -Arg -2生成了發(fā)射熒光的Rho -Arg,Rho -Arg 通過(guò)能量轉(zhuǎn)移而將PPE -C O 2-熒光高效猝滅。這種方法在1h 內(nèi)可以檢測(cè)到10fmol 的 -secretase 蛋白酶,這一研究結(jié)果對(duì)

26、于新藥物的篩選與發(fā)現(xiàn)有重要意義44,45。Whitten 研究組46將QTL 的方法擴(kuò)展到檢測(cè)蛋白酶。他們將能與待檢測(cè)的酶發(fā)生特異作用的多肽2375 第11期賀 芳等 基于水溶性共軛聚合物的蛋白質(zhì)檢測(cè)分子(T的兩端分別連接上生物分子(B和猝滅劑(Q形成 QTB ,然后生物分子端的B 通過(guò)biotin -avidin 作用與發(fā)光聚合物連接而形成 QTP ,發(fā)光聚合物的熒光被高效猝滅;若先將QTB 和酶反應(yīng),再和聚合物微球混合,由于多肽分子被水解,猝滅劑遠(yuǎn)離發(fā)光聚合物,結(jié)果其熒光不被猝滅。因此通過(guò)檢測(cè)聚合物熒光強(qiáng)度的變化,可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白酶的靈敏檢測(cè)。最近我們實(shí)驗(yàn)室47報(bào)道了一種基于陰離子的水溶性聚芴

27、PFP -SO 3-的乙酰膽堿酯酶的檢測(cè)體系(如圖4。在該體系中,底物為AC h -dabcyl,其一端為季銨鹽,另一端修飾有高效猝滅劑dabcyl 。當(dāng)向陰離子聚芴PFP -SO 3-中加入底物ACh -dabcyl 時(shí),由于底物與聚合物通過(guò)靜電相互作用導(dǎo)致聚合物發(fā)生聚集,聚合物的熒光被猝滅99%以上。此時(shí)加入乙酰膽堿酯酶,底物ACh -dabcyl 被水解得到相反電荷的底物,由于靜電排斥猝滅劑遠(yuǎn)離聚合物,聚合物的熒光逐漸恢復(fù)。該體系具有很高的檢測(cè)靈敏度而且可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè),檢測(cè)靈敏度可達(dá)0 05U ml 。另外,我們還實(shí)現(xiàn)了對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制劑的高靈敏度篩選,為抗老年癡呆疾癥的高效新藥篩選

28、提供了 新方法。圖4 基于共軛聚合物的乙酰膽堿酯酶檢測(cè)原理圖47Fig.4Schematic represen tation of acetylcholinesterasedetection based on water -soluble conjugated polymer 47蛋白激酶(protein kinase主要用于從三磷酸腺苷(ATP轉(zhuǎn)移磷酸基到酪氨酸(Tyr、絲氨酸(Ser和蘇氨酸(Thr等,對(duì)于細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、分化和增殖都具有非常重要的作用48,49。經(jīng)典的蛋白激酶檢測(cè)方法主要是放射性標(biāo)記ATP 法50或抗體-抗原法51。最近Whitten 研究組52利用共軛聚合物來(lái)檢測(cè)蛋白激

29、酶并拓寬了檢測(cè)范圍。將修飾過(guò)的發(fā)光聚合物DPS -PPE 組裝到微球表面,由于微球表面的電荷密度高,金屬離子(Ga 3+53可以緊密地結(jié)合到微球表面從而使微球能進(jìn)一步和磷酸基作用。將與激酶作用的多肽底物共價(jià)標(biāo)記熒光猝滅小分子,蛋白激酶將ATP 中的 -磷酸基轉(zhuǎn)移給多肽底物中的酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘留物,磷酸化的多肽與微球上的金屬離子有特定作用從而導(dǎo)致DPS -PPE 熒光猝滅。當(dāng)?shù)鞍准っ敢种苿┘尤霑r(shí),多肽底物磷酸化作用被阻礙,不與微球作用,從而DPS -PPE 熒光不被猝滅。利用這種方法檢測(cè)激酶有許多優(yōu)點(diǎn):對(duì)蛋白激酶應(yīng)用廣泛,不需要抗體和放射性元素標(biāo)記,操作簡(jiǎn)單可進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),靈敏度高,檢測(cè)

30、濃度可達(dá)到pg 級(jí)。3.2.4 抗原-抗體的檢測(cè)抗原-抗體的研究在疾病診斷以及生物學(xué)領(lǐng)域具有重大意義。目前對(duì)抗原-抗體的研究主要是采用免疫測(cè)試法54。這種方法的靈敏度和選擇性都較好,但是價(jià)格較高、必需的多步洗滌與分離步驟使該法條件苛刻而且費(fèi)時(shí)。而同相溶液中的免疫測(cè)試具有簡(jiǎn)單易行、快速和便宜的優(yōu)點(diǎn),而且它還可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。Hee ger 研究組55首次將共軛聚合物應(yīng)用于抗原-抗體作用研究,實(shí)現(xiàn)了同相溶液中抗原或抗體的靈敏檢測(cè)。他們將帶有正電荷的聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯(PDMAE聚電解質(zhì)以1 1的比例加入到帶負(fù)電荷的共軛聚合物MPS -PPV 的水溶液中,獲得電荷中性的復(fù)合體系(charge

31、neutral complex,CNC。C NC 不僅可以被陽(yáng)離子如MV 2+等猝滅還可以被陰離子如DNP -BS -等猝滅。向CNCDNP -BS -的溶液中加入能和DNP -BS -有特異性相互作用的抗-DNP 抗體,DNP -B S -與抗-DNP 抗體特異性結(jié)合后遠(yuǎn)離C NC,CNC 的熒光恢復(fù),通過(guò)檢測(cè)抗體加入前后C NC 的熒光信號(hào)變化,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原-抗體相互作用的靈敏檢測(cè)(圖5。Bunz 等56,57研究發(fā)現(xiàn)利用陽(yáng)離子共軛聚合物作為生物傳感器,聚合物與蛋白質(zhì)之間存在非常強(qiáng)的非特異性相互作用。Heeger 等利用電中性的配合物CNC 為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體,可以降低非特異性相互作用的影響。

32、Swanson 等58發(fā)展了一種利用具有熒光猝滅能力的聚電解質(zhì)PEPT poly(2-e thynylpyridinium tosylate with propargyl side來(lái)檢測(cè)抗原-抗體的新體系,實(shí)驗(yàn)表明陽(yáng)離子聚合物PEPT 可以高效地猝滅陰離子撒旦黃染料的熒光。他們將撒旦黃染料標(biāo)記到抗原(或抗體分子上,加入PEP T 后由于靜電作用PEP T 與撒旦黃染料分子接近,撒旦黃染料的熒光被高效猝滅。當(dāng)加入特定的抗體(或抗原后,抗體-抗原發(fā)生特定的相互作用而使撒旦黃染料分子遠(yuǎn)離PE PT 從而其熒光恢復(fù)。這種方法還可擴(kuò)展到檢測(cè)biotin -avidin 的相互2376 化 學(xué) 進(jìn) 展第2

33、1卷第 11 期 賀 芳等 基于水溶性共軛聚合物的蛋白 質(zhì)檢測(cè) 7 2377 作用。該方法可以大幅提高檢測(cè)靈敏度。 Patel G N, Chance R R, Witt J D. J. Chem. Phys. , 1979, 70: 4387 4392 8 9 Elsenbaumer R L, Jen K Y, Oboodi R. Synth. Met . , 1986, 15: 169 174 Sato M A , Tanaka S, K aeriyama K. Chem. Commun. , 1986, 1346 1347 10 Sugimoto R , Takeda S, Gu H B

34、, Yoshino K. Chem. Express, 1986, 1: 635 638 11 12 Hotta S, Rughooputh S D D V , Heeger A J, 215 Wuld F. Macromolecules, 1987, 20: 212 3015 13 14 3019 Lecl erc M , Diaz F M , Wegner G . Makromol. Chem. , 1989, 190: Lecl erc M. J. Polym. Sci . Part A: Polym. Chem. , 2001, 39: 2867 2873 Bernier S, Gar

35、reau S, Bera -Aberem M, Gravel G, Leclerc M. J. Am. Chem. Soc. , 2002, 124: 12463 12468 圖 5 基于共軛聚合物的抗原 抗體檢測(cè)原 理圖 55 Fig. 5 Schematic representation of antigen antibody detection 15 Tan C, Pinto M R, Kose M E, Ghiviriga I, Schanze K S. A dv. Mat er. , 2004, 16: 1208 1212 based on water soluble conjuga

36、ted polymer 55 - 16 17 St ork M, Gaylord B S, Heeger A J, Bazan G C. Adv. Mat er. , 2002, 14: 361 366 Tan C, Pinto M R, Schanze S. Chem. Commun. , 2002, 2: 446 447 4 結(jié)論與展望 水溶性的共軛聚合物由于具有光學(xué)信號(hào)放大效 18 19 Pint o M R, K istal B M, Schanze S. Langmuir, 2003, 19: 6523 6533 Prince R B, Saven J G, Wolynes P G,

37、 Moore J S. J. Am. Chem. Soc. , 1999, 121: 3114 3121 應(yīng), 在生物傳感研究中表現(xiàn)出優(yōu)良的應(yīng)用前景。與 傳統(tǒng)的小分子熒光探針相比, 水溶性共軛聚合物可 以放大熒光信號(hào), 大大提高檢測(cè)體系的靈敏度 59, 60 。 20 另外, 由于其側(cè)鏈帶有高密度的電荷, 因此可以直接 通過(guò)聚合物與蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用發(fā)展操作 簡(jiǎn)單的檢測(cè)體系。目前, 大部分共軛聚合物生物傳 感體系都依賴(lài)于聚合物與分析底物之間的靜電相互 作用, 最大的缺點(diǎn)是在溶液中由于生成電中性復(fù)合 物而容易生成沉淀。如果將與分析底物有特異性相 互作用的分子共價(jià)連接在共軛聚合物上, 則可解

38、決 這一問(wèn)題。在活體或細(xì)胞水平上用于高靈敏、 高選 擇性識(shí)別臨床中腫瘤標(biāo)志物( 如蛋白質(zhì)、 的研究, 酶 對(duì)于重大疾病的早期診斷與治療具有重要意義。另 外, 如何實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)是今后共軛聚 合物生物檢測(cè)的一個(gè)重要發(fā)展方向 參 考 文 獻(xiàn) 1 Roncali J, G arreau R, Delabouglise D, Garnier F, Lemaire M. Chem. Commun. , 1989, 679 2 681 61 Lahiri S, Thompson L J, Moore J S. J. Am. Chem. Soc. , 2000, 122: 11315 11319

39、21 22 Zhou Q , Swager T M . J. Am. Chem. Soc. , 1995, 117: 7017 7018 Zhou Q, Swager T M. J. Am. Chem. Soc. , 1995, 117: 12593 12602 23 24 M ullen K, Wegner G . Electronic Materials: The Oligomer Approach. Weinheim: Wiley -VCH, 1998 Thienpont H, Rikken G L J A, Meijer E E, Hoeve W, Wynberg H. Phys. R

40、ev. Lett . , 1990, 65: 2141 2144 25 26 Swager T M . Acc. Chem. Res. , 1998, 31: 201 207 Chen L, Xu S, McBranch D , Whitten D. J. Am. Chem. Soc. , 2000, 122: 9302 9303 。 27 Tan C, Pinto M R, Schanza K S. Chem. Commun. , 2002, 446 447 28 29 Lavigne J J, Broughton D L, Wilson J N, Erdogan B, Bunz U H F

41、. Macromolecules, 2003, 36: 7409 7412 Fan C, Wang S, Hong J W, et al. Proc. N atl. Acad. Sci. USA , 2003, 100: 6297 6301 Shi L M , Garnier F, Roncali J. Synth. Met . , 1991, 41 43: 547 550 30 31 Ho H A, Leclerc M. J. Am. Chem. Soc. , 2004, 126: 1384 1387 Tang Y, Feng F, He F, Wang S, Li Y, Zhu D. J.

42、 Am. Chem. Soc. , 2006, 128: 14972 14976 3 McQuade D T, Pullen A E, Swager T M. Chem. Rev. , 2000, 100: 2537 2574 4 5 6 Leclerc M. A dv. Mater. , 1999, 11: 1491 1498 Garnier F. Angew. Chem. Int. Ed. , 1989, 28: 513 Leclerc M, Ho H A . Synlett, 2004, 2: 380 387 517 32 Nilsson K P R, Rydberg J, Baltze

43、r L, Ingan s O. Proc. Natl . A cad. Sci. U SA , 2003, 100: 10170 10174 33 Nilsson K P R , Ingan s O. Macromolecules, 2004, 37: 9109 9114 2378 34 N ilsson K P R, Herland A, Hammarstrom P, 化 學(xué) 進(jìn) 48 展 第 21 卷 Ingan s O. Nick J A, Yong S K , Brown K K, Avidi N J, Arndt P G , Worthen G S. J. Immunol . , 2

44、000, 164: 2151 2159 Biochemistry, 2005, 44: 3718 3724 35 36 37 Chen L, M cBrach D W, Wang H L, et al. Proc. N atl. A cad. Sci. USA , 1999, 96: 12287 12292 50 51 6727 Jones R M, Bergstedt T S, M cBranch D W, Whitten D G. J. Am. Chem. Soc. , 2001, 123: 6726 Huang F, Wang X H, Wang D L, Yang W, Cao Y.

45、Polymer, 2005, 46: 12010 38 39 12015 Zhu D . Macromol. Rapid 52 53 54 49 Vlahos C J, M cDowell S A , Clerk A . Nat . Rev. Drug Discov. , 2003, 2: 99 113 Antonsson A, Marshall C J, Montessuit S, Arkinstall S. Anal . Biochem. , 1996, 267: 294 299 Angeles T S, Steffler C, Bartlett B A, Hudkins R L, Stephens R M , K aplan D R, Dionne C A. Anal. Biochem. , 1996, 236: 49 Technol. , 2004, 2: 183 192 55 An L, Tang Y , Wang S , Li Y, Commun. , 2006, 27: 993 997 Xia W, Rininsland F, Wittenburg S K, et al . Assay Drug Dev. Andersson L, Porath J. Anal. Biochem. , 1986,