酵母富硒工藝優(yōu)化研討分析

1、酵母富硒工藝優(yōu)化研討分析        文章標(biāo)題：酵母富硒工藝優(yōu)化研討分析摘要：本文通過正交試驗(yàn)，對(duì)酵母富硒工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：釀酒酵母具有較強(qiáng)的富硒能力。在適宜的條件下，以YEPD為培養(yǎng)基、加硒量16mg/L、8的接種量、28培養(yǎng)30h，有機(jī)硒含量可達(dá)12.39mg/L、轉(zhuǎn)化率為82.62.關(guān)鍵詞：釀酒酵母；富硒；優(yōu)化研究硒是人體生命中不可缺少的微量元素之一，在人體內(nèi)總含量為1420毫克，廣泛分部于所有組織器官中，濃度高者有肝、胰、心、脾、牙及指甲，而脂肪組織中濃度最低，它對(duì)人體的正常代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用

2、，因而被喻為“生命火種”、“抗癌之星”。同時(shí)硒是一種稀散元素，不同地區(qū)食物中的硒含量不同，這與地理環(huán)境中的硒含量有關(guān)，在世界27個(gè)國家及美國幾十個(gè)洲的流行病理學(xué)調(diào)查研究結(jié)果表明：土壤、食品、水中的含硒水平越低，癌癥及心腦血管疾病的發(fā)病率及死亡率越高。硒是構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶的成份，參于輔酶A和輔酶Q的合成，是良好的營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、對(duì)抗金屬的解毒劑，缺“硒”將會(huì)導(dǎo)致40多種疾病的發(fā)病率增高。然而自然界的“硒”在地殼中的含量極低，且與其它元素共生，人體難以吸收，全世界共有40多個(gè)國家缺硒，我國缺硒省份高達(dá)22個(gè)。目前國內(nèi)外盛行用無機(jī)硒作為補(bǔ)硒制品，如亞硒酸鈉片劑。但是無機(jī)硒與有機(jī)硒相比，有

3、生物活性低而毒副作用大，且不易吸收等問題。針對(duì)我國缺硒現(xiàn)象是普遍存在的這一現(xiàn)狀，如能通過每天攝入一定量的富硒食品即能達(dá)到理想的補(bǔ)硒效果，從而實(shí)現(xiàn)強(qiáng)身健體、延長壽命的作用己成為目前功能性食品研究的迫切課題之一。在研究眾多的富硒制劑和食品添加劑中，酵母經(jīng)富硒培養(yǎng)后得到的富硒酵母，因其自溶物中有機(jī)硒含量高，同時(shí)還含有豐富的氨基酸、核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)和一些微量元素與維生素，可作為良好的富硒食品的添加劑而倍受重視。而如何獲得含硒量高的酵母是一個(gè)重要的前提，本文研究了釀酒酵母1605富硒工藝的優(yōu)化。材料與方法1.1材料1.1.1菌種釀酒酵母1605。1.1.2培養(yǎng)基（1）YEPD培養(yǎng)基葡萄糖，蛋白胨，酵

4、母膏，自然PH值，固體加瓊脂、121滅菌15分鐘。（2）麥芽汁培養(yǎng)基自制麥芽汁10º（采用分段糖化法，將麥芽粉:水1:3混勻，先在54糖化h，再升溫到65糖化3040分鐘，再在72糖化40分鐘，煮沸過渡，調(diào)糖度至10º），pH=6.0。（3）加入的硒均單獨(dú)滅菌。1.1.3試劑0.2mol/LEDTA-2Na；5NaOH；0.5、-二氨基聯(lián)苯胺；甲苯；1:1HCl；1g/ml硒標(biāo)準(zhǔn)溶液等。1.1.4儀器722S分光光度計(jì)；LRH150B生化培養(yǎng)箱；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)；DSX280A不銹鋼手提式消毒器；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)；101-2型干燥箱等。1.2方法菌種活

5、化馴化培養(yǎng)基配制發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵液分離清洗新鮮硒酵母干燥(100，5h)富硒酵母取上清液硒含量測(cè)定計(jì)算酵母硒含量及有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率1.2.1菌種活化、馴化將少量固體原種接入YEPD液體培養(yǎng)基中，在28培養(yǎng)25小時(shí)，后再轉(zhuǎn)接入加有適量硒的YEPD液體中進(jìn)行馴化培養(yǎng)。1.2.2富硒工藝優(yōu)化首先通過預(yù)備試驗(yàn)確定因素和水平，然后通過正交試驗(yàn)確定其最優(yōu)化工藝條件。1.2.3酵母產(chǎn)量的測(cè)定將待分離發(fā)酵液用高速離心機(jī)4000rpm離心20分鐘，分成兩部分，上清液取出備后續(xù)測(cè)定使用，下層酵母沉淀用無菌水清洗兩遍，得新鮮濕酵母。將濕酵母置100的烘箱內(nèi)干燥至恒重。1.2.4酵母中硒含量的測(cè)定及富硒能力(有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率)計(jì)

6、算-3，3-二氨基聯(lián)苯胺比色法1.2.4.1測(cè)定原理在PH條件下，硒與3、3二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)形成穩(wěn)定的Se-DAB絡(luò)合物，顯色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成。在PH6左右時(shí)，通過甲苯萃取，在該體系中絡(luò)合物最大吸收波長為420nm?？赏ㄟ^分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，先繪制出標(biāo)準(zhǔn)硒曲線，然后再測(cè)出樣品吸光度，可從該標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的硒含量。1.2.4.2硒標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取0.1000g硒，置于50ml小燒杯中，力入1:1鹽酸10ml,加熱溶解，冷卻并轉(zhuǎn)移至100ml容罱瓶中，用10硝酸溶液洗小燒杯合并沈液于容帚瓶中，并用10硝酸稀釋至刻度。此溶液每毫升含1毫克硒，用時(shí)可稀釋成每毫升含1微克硒。1.2

7、.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確吸取1gml硒標(biāo)準(zhǔn)液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，分別移入分液漏斗中，加水至35ml。分別        加入5EDTA-2Na溶液1ml，搖勻，用1:1鹽酸調(diào)節(jié)pH2-3左右，各加0.53，3-氨基聯(lián)苯胺溶液4ml，搖勻，置于暗處30分鐘，再用5氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至中性，加10ml甲苯振搖2分鐘，靜置分層，棄去水層，甲苯層通過棉花栓過濾于比色皿中，于420nm波長處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。1.2.4.4殘留無機(jī)硒含量的測(cè)定取適量樣品，5000rpm高速離心

8、機(jī)離心30min，取20ml上清夜，加水至35ml，加入5EDTA-2Na溶液1ml，以下同標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品測(cè)得的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)的硒含量，此為無機(jī)硒含量。1.2.4.5有機(jī)硒含量的測(cè)定有機(jī)硒含量=總硒含量一殘留無機(jī)硒含量結(jié)果與分析2.1正交因素水平確定2.1.1培養(yǎng)時(shí)間選擇發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間直接影響酵母生長的幾個(gè)不同階段，酵母中的硒含量取決于酵母生長過程中吸收、轉(zhuǎn)化無機(jī)硒的量。10試管種子分別接種到含亞硒酸鈉9mg/L、12mg/L、15mg/L培養(yǎng)基中，28培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間測(cè)定酵母的數(shù)量，獲得酵母生長曲線（如圖2）。從圖2可以看出，培養(yǎng)至2535h時(shí)酵母生長達(dá)到穩(wěn)定期，酵母產(chǎn)量基

9、本接近最高值。因此在后面的正交試驗(yàn)中選取了發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為25h、30h、35h三個(gè)水平。2.1.2硒濃度的選擇酵母對(duì)于硒的轉(zhuǎn)化，在一定的濃度下可以將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。在高濃度硒存在的環(huán)境下，酵母雖然仍可以生長，但體內(nèi)硒過量而轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒沉積在細(xì)胞內(nèi)，使酵母出現(xiàn)微紅色，甚至紅色。因此由實(shí)驗(yàn)得到在硒濃度為20mg/L條件下，酵母呈現(xiàn)出微紅色，此值可認(rèn)為是一個(gè)臨界點(diǎn)，即菌體內(nèi)無機(jī)硒開始積累的標(biāo)志，因此在正交試驗(yàn)中選取了發(fā)酵培養(yǎng)基中硒濃度12mg/L、16mg/L、20mg/L三個(gè)水平。2.1.3接種量和培養(yǎng)基的選取在一般的發(fā)酵培養(yǎng)中接種量多為10左右，此處為了研究初始菌量對(duì)硒產(chǎn)量的影響，選取了8、

10、10、12三個(gè)水平。而對(duì)于不同的培養(yǎng)基條件，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其酵母生長量基本一致，即在麥芽汁中和YEPD培養(yǎng)基中的酵母生長情況是一致的，二者沒有太大的區(qū)別。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取了YEPD培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基。2.2富硒工藝優(yōu)化酵母富硒工藝的優(yōu)化，是以酵母中的硒含量及有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的高低來衡量的，通過以上分析，影響酵母中硒含量及有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的主要因素有以下個(gè)，富硒正交試驗(yàn)各因素水平見表1表1富硒正交試驗(yàn)因素水平表因素水平123A（Se含量mg/L）121620B（培養(yǎng)時(shí)間/h）253035C（接種量/）81012通過正交試驗(yàn)確定酵母發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)工藝條件，以上面所取的三個(gè)因素，三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。試

11、驗(yàn)結(jié)果見表2。表2富硒正交試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)號(hào)試驗(yàn)條件試驗(yàn)結(jié)果ABC硒含量（mg/L）轉(zhuǎn)化率（）11116.6266.5421226.0160.3931337.3271.46422112.3982.62523212.0278.45621310.1067.41733113.2464.31831213.2164.02932312.7872.36/36.659.9810.75/311.5010.3910.41/3RcR6.430.880.68A3B3C1/366.1365.9971.16/376.1671.7967.62/3RcR10.035.803.54A2B2C1從表2上比較可經(jīng)看出，轉(zhuǎn)化率高的最優(yōu)化

12、組合是A2B2C1，即加硒量為16mg/L、接種量為8、在28培養(yǎng)30h。同時(shí)可以從表2看出，三種因素在所選水平范圍內(nèi)，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響是不同的。對(duì)硒產(chǎn)量和硒的轉(zhuǎn)化率影響最大的是硒的添加量和培養(yǎng)時(shí)間；如果僅從硒產(chǎn)量的角度而言A3B3C1組合產(chǎn)有機(jī)硒產(chǎn)量較高，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的高硒濃度有利于硒的產(chǎn)量提高，但是這樣并不經(jīng)濟(jì)。通過這種方法雖可以在一定的范圍內(nèi)使有機(jī)硒的含量得以提高，但是無機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率卻比較低，致使發(fā)酵液中的無機(jī)硒殘留較高，不利環(huán)境保護(hù)和資源的有效利用。所以這一組合并不可行。在對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的選取上，當(dāng)菌量達(dá)到一定的濃度后，其有機(jī)硒的產(chǎn)量也不會(huì)發(fā)生太大的變化，所以應(yīng)該在保證高硒轉(zhuǎn)化率的前提

13、下，盡可能的縮短發(fā)酵時(shí)間。這是因?yàn)楫?dāng)酵母生長平衡期后，要有相當(dāng)數(shù)量的酵母發(fā)生自溶，使體內(nèi)以積累的有機(jī)硒釋放到培養(yǎng)基質(zhì)中而造成浪費(fèi)。從經(jīng)濟(jì)合理的角度出發(fā)，綜合以上幾種因素，我們選取了A2B3C1為最優(yōu)組合。在該條件下，有機(jī)硒的產(chǎn)量可達(dá)12.39mg/L、無機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率可達(dá)82.62。3結(jié)論3.1該酵母菌的最優(yōu)條件組合是：加硒量16mg/L、接種量8、在28下培養(yǎng)30h。在該條件下，生產(chǎn)富硒酵母時(shí)，有機(jī)硒的含量和硒的轉(zhuǎn)化率分別可達(dá)12.39mg/L和82.62；3.2酵母的富硒能力在20mg/L的濃度下，隨濃度的升高而提高其轉(zhuǎn)化率，但在該濃度之上時(shí)，這種轉(zhuǎn)化能力開始降低；3.3酵母大都具有較強(qiáng)的富硒能力，也可作為富硒酵