牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)

1、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)I 目的：建立牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞制品生產(chǎn)規(guī)程。II 范圍：適用于牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生產(chǎn)； 適用于技術(shù)部和各中心技術(shù)組的所有技術(shù)人員。III 職責(zé)：1. 生產(chǎn)主管負(fù)責(zé)本制度的執(zhí)行和監(jiān)督；2. 技術(shù)組的所有技術(shù)人員要嚴(yán)格按照本流程的要求進(jìn)行操作；3. 監(jiān)督員負(fù)責(zé)全程監(jiān)督，并即時(shí)按要求填寫牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)記錄和生產(chǎn)試劑耗材記錄表。附表1 牙髓/骨髓/脂肪/胎盤/臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)記錄附表2 生產(chǎn)試劑耗材記錄表IV 規(guī)程：一、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代操作消化法：1.儀器耗材1）10ml移液管2） 培養(yǎng)皿3） 50ml離心管4） 100m篩網(wǎng)5） T75培養(yǎng)瓶6） 15ml離心管2.

2、試劑1）生理鹽水2）培養(yǎng)基3）膠原酶3. 酶消化法操作流程3.1 將浸在含1%雙抗的生理鹽水中的牙齒取出，吸取運(yùn)輸液4ml交給質(zhì)檢，并填寫樣本取樣單，牙齒置于75%酒精中浸泡30min；3.2 取出牙齒在含10ml生理鹽水的培養(yǎng)皿中清洗2-3遍，用止血鉗固定牙冠，持骨鉗夾碎牙根部，暴露出牙髓，用鑷子取出牙髓并放入含有適量生理鹽水的培養(yǎng)皿中；3.3 用剪刀將牙髓組織塊剪碎成1mm3 ，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加入生理鹽水至30ml,再加入10ml 0.2%膠原酶；3.4 置于37恒溫?fù)u床，180rmp消化30min ；3.5 用100m濾網(wǎng)過濾；3.6 1200 rpm離心10min ，吸取洗滌

3、液4ml交給質(zhì)檢，并填寫樣本取樣單；附表3 樣本取樣單3.7 棄剩余上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為107/ml,置于75cm2培養(yǎng)瓶中,放入37，CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。4. 組織塊法操作流程：4.1 將浸在含1%雙抗的生理鹽水中的牙齒取出，吸取運(yùn)輸液4ml交給質(zhì)檢，并填寫樣本取樣單，牙齒置于75%酒精中浸泡30min；4.2 取出牙齒在含10ml生理鹽水的培養(yǎng)皿中清洗2-3遍，用止血鉗固定牙冠，持骨鉗夾碎牙根部，暴露出牙髓，用鑷子取出牙髓并放入含有適量生理鹽水的培養(yǎng)皿中；4.3 用剪刀將牙髓組織塊剪碎成1mm3 ，將組織塊均勻鋪到T25培養(yǎng)瓶（用適量FBS潤(rùn)濕瓶底）瓶底；4.6 倒置培養(yǎng)瓶，并加入5m

4、l培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4.7 12-24h后，將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，將牙髓組織塊浸入工作液中。二、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞換液1.耗材1）10ml移液管2）15ml離心管2.試劑培養(yǎng)基3. 操作流程3.1 鏡下觀察狀態(tài)細(xì)胞；3.2 吸取上清液4ml交給質(zhì)檢，并填寫樣本取樣單；3.3 吸取上清液于50ml離心管中留作精華液（原代培養(yǎng)上清不留），并補(bǔ)充新的培養(yǎng)基；3.4 觀察細(xì)胞并將其置于37，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。三、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)1. 耗材1）10ml移液管2）50ml離心管3） 培養(yǎng)瓶4） 15ml離心管2. 試劑1）生理鹽水2）胰酶3）血清4）培養(yǎng)基3. 操作流程3.1 顯微鏡觀察，觀

5、察培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞密度到達(dá)80%90%，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)；3.2 吸取上清液于50ml離心管中留作精華液（原代培養(yǎng)上清不留），T75培養(yǎng)瓶中加入10ml生理鹽水洗滌貼壁細(xì)胞； 3.3 吸取洗滌液4ml交給質(zhì)檢，并填寫樣本取樣單；3.4 倒出剩余洗滌液（生理鹽水），再加入10ml生理鹽水+0.05%胰酶，進(jìn)行細(xì)胞消化，消化的第一瓶鏡下觀察，細(xì)胞收縮即可加入等體積血清終止消化；3.5將細(xì)胞收集到50ml離心管中，1200rpm，6min，棄上清，重懸，加入培養(yǎng)基，然后按照1:2或1:3進(jìn)行傳代。四、 牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞成品制備1. 耗材1）10ml移液管2）50ml離心管3）15ml離心管4）西林瓶/輸

6、血袋2. 試劑1）生理鹽水2）胰酶3）血清4）干細(xì)胞保存液3. 操作流程3.1 待細(xì)胞擴(kuò)增總數(shù)達(dá)所需細(xì)胞數(shù)量后，吸取上清液于50ml離心管中留作精華液（原代培養(yǎng)上清不留），T75培養(yǎng)瓶中加入10ml生理鹽水洗滌一遍；3.2 加入10ml生理鹽水+0.05%胰酶，進(jìn)行細(xì)胞消化，消化的第一瓶鏡下觀察，細(xì)胞收縮即可加入等體積血清終止消化；3.3 將細(xì)胞收集到50ml離心管中，1200rpm，10min；3.4 棄上清，細(xì)胞沉淀用30ml生理鹽水洗滌二次，1200rpm，室溫離心10min。3.5 取第二次洗滌離心后的上清20ml交給給質(zhì)檢部分，并填寫樣本取樣單；3.6用干細(xì)胞保存液/生理鹽水重懸細(xì)胞

7、，轉(zhuǎn)入專用的無菌西林瓶/生理鹽水中，封口，貼標(biāo)簽，放置4保存。3.7 完成初包裝后，操作員立即將成品送交包裝部門。5、 牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存1. 耗材1）10ml移液管2）50ml離心管3）15ml離心管4）凍存管2. 試劑1）生理鹽水2）胰酶3）血清4）凍存液3. 操作流程3.1 將制備好的MSC于1200rpm室溫，離心10min。3.2 棄去上清，將細(xì)胞懸浮于適量?jī)龃嬉褐?，使?xì)胞濃度在107個(gè)細(xì)胞/毫升，置于低溫?zé)o菌凍存管中。3.3 將細(xì)胞交給庫(kù)管員經(jīng)過程控降溫后于液氮中冷凍保存，并填寫凍存樣品交接單。附表4 凍存樣品交接單6、 牙髓干細(xì)胞的復(fù)蘇1. 耗材1）10ml移液管2）50ml

8、離心管3）15ml離心管4）培養(yǎng)瓶2. 試劑1）生理鹽水2）培養(yǎng)液3. 操作流程3.1 將液氮中的細(xì)胞取出于37水浴中迅速融化；3.2 將細(xì)胞置于裝有1015倍ml生理鹽水無菌離心管中，1200rpm離心10min；3.3 棄上清，加入30ml生理鹽水洗滌細(xì)胞兩次；3.4 取第一次洗滌離心后的上清20ml交給給質(zhì)檢部分，并填寫樣本取樣單；3.5 棄上清，重懸細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入培養(yǎng)液，吹勻；3.6 將單細(xì)胞懸液種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。備注：1. 每次進(jìn)行操作前，需將萬級(jí)車間和百級(jí)實(shí)驗(yàn)臺(tái)照射紫外線30min，風(fēng)機(jī)開啟后10-15min后方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所進(jìn)行操作；2. 進(jìn)入GMP車間后，實(shí)驗(yàn)人員先進(jìn)入物品存放間取已經(jīng)表面消毒過的垃圾桶、廢液缸、實(shí)驗(yàn)耗材等進(jìn)入相應(yīng)操作間，并從配液間取出相關(guān)使用試劑放于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)；3. 細(xì)胞的取出與放回：開啟培養(yǎng)箱前，需75%擦拭手掌后方可取放細(xì)胞；4. 操作細(xì)胞過程，手臂盡量在實(shí)驗(yàn)臺(tái)進(jìn)行操作，不要將手臂反復(fù)拿出實(shí)驗(yàn)臺(tái)，如拿出手臂再進(jìn)入需重新噴灑酒精，方可進(jìn)入；5. 鏡下觀察，看是否有雜菌的感染，若有雜菌感染，立即封口后進(jìn)行清理，不做留用。6. 清場(chǎng)：擦拭操作臺(tái)，用酒精棉球擦拭每一個(gè)有操作接觸到過的地方；將廢液缸和垃圾桶噴灑75%酒精后放置于污物出口；實(shí)驗(yàn)臺(tái)內(nèi)未用完的耗材需全部放置于不銹鋼推車上，臺(tái)內(nèi)不留任何