生物素、親和素標(biāo)記技術(shù)

1、生物素、親和素標(biāo)記技術(shù)廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科廖偉嬌一、生物素及其理化性質(zhì)1 概念2 分子式3結(jié)構(gòu)特點(diǎn)4溶解特性5等電點(diǎn)6其它特性 1 概念： 生物素(biotin)是動、植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H。2分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.313結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 咪唑酮環(huán)/四氫噻吩環(huán) 結(jié)合親和素 側(cè)鏈末端羧基結(jié)合蛋白質(zhì)4溶解特性： 難溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)5等電點(diǎn)： PH=3.56其它特性： 羧基需經(jīng)活化修飾才能結(jié)合蛋白質(zhì) （羧基活化的生物素，稱為活化生物素，也叫生物素衍生物）2生物素衍生物的種類及特性： 1 生物素羥丁酰亞胺酯(BNHS

2、)： DMF制備：生物素 + N-羥基琥珀酰亞胺 二環(huán)己基碳二亞胺標(biāo)記特點(diǎn)： BNHS中的羧基與蛋白質(zhì)中的賴氨酸氨基 結(jié)合達(dá)到標(biāo)記的目的適用于：標(biāo)記Ab、酶、中性或偏堿性Ag、DNA2長臂活化生物素(BCNHS)： DMF + 6-氨基己酸制備：生物素 + N-羥基琥珀酰亞胺 二環(huán)己基碳二亞胺 (在BNHS的B與羧基之間插入2分子的6-氨基己酸 ）標(biāo)記特點(diǎn): (同BNHS) BCNHS中的羧基與蛋白質(zhì)中的賴氨酸氨基結(jié)合達(dá)到標(biāo)記的目的適用：(同BNHS) 標(biāo)記Ab、酶、中性或偏堿 性的Ag、DNA3 生物素酰肼(BHZ)：制備：生物素 +水合肼標(biāo)記特點(diǎn)： BHZ與蛋白質(zhì)中的醛基結(jié)合而標(biāo)記適用：標(biāo)

3、記偏酸性的蛋白質(zhì)、酶、DNA三、親和素及其理化性質(zhì)1 概念2 分子式3結(jié)構(gòu)特點(diǎn)4溶解特性5等電點(diǎn)6其它特性1 概念： 親和素(avidin)：是動物微生物中提取的一種含10%碳水化合物的堿性糖蛋白。 鏈霉親和素：是從鏈球菌屬的菌培養(yǎng)液中提取的一種蛋白質(zhì)2 分子量： A: 6.7KD SA: 66.5KD3 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 每分子由四個亞基組成4溶解特性：溶于水，C=5mg/ml 5等電點(diǎn)： A: PH=10.5 SA: PH= 6.06比活性： A12u/mgP SA 14u/mgP四、親和素的活性及其測定1 親和素的活性：是表示親和素結(jié)合生物素的能力，即：ugB/mgA或ugB/mgSA。2活性

4、測定： 羥基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（紅色） B A-B （出現(xiàn)黃色時B的量） 分光光度法：五、生物素標(biāo)記物及親和素標(biāo)記物的制備：1 生物素標(biāo)記物的制備： B +Ab/Ag/E 交聯(lián)劑 B-Ab/Ag/E2親和素標(biāo)記物的制備： A/SA+ Ab/Ag/ E 交聯(lián)劑 A/SA-Ab/Ag/E六、技術(shù)類型： 可有Ag與Ab反應(yīng)的各種免疫方法：夾心法、間接法、競爭法等，在次基礎(chǔ)上引入A-B系統(tǒng)。1BAB法： Ag+BAb Ag-AbB A Ag-AbB-A BE Ag-AbB-A-BE 特點(diǎn)：以游離A分別連接B-Ab和B-E 返回2BA法： Ag+BAb Ag-AbB AE Ag-AbB-A-BE特點(diǎn)：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省 卻了加B-E的步驟3ABC法： A+BE A- BE-ABC Ag+BAb Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC 特點(diǎn)：將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC返回+A+A Ag-Ab1-Ab2-B + A-