蛋白質組學及技術介紹

1、蛋白質組學蛋白質組學 概念 蛋白質組是在一個細胞的整個生命過程中由基因組表達的以及表達后修飾的全部蛋白質。 蛋白質組學是蛋白質組概念的延伸。是蛋白質的規(guī)模化研究，從蛋白質水平和生命本質層次上研究和發(fā)現(xiàn)生命活動的規(guī)律和重要生理、病理現(xiàn)象的本質，揭示基因活動的動態(tài)表達。 蛋白質水平的分析不僅為生物分子體系提供最有效的實時分析模型而且也獲得了DNA和RNA水平上不易獲得的信息。蛋白質的研究內容主要有兩方面：1、結構蛋白質組學：主要是蛋白質表達模型的研究，包括蛋白質氨基酸序列 分析及空間結構的解析種類分析及數(shù)量確定;2、功能蛋白質組學：主要是蛋白質功能模式的研究，包括蛋白質功能及蛋白質間的相互作用。研

2、究研究內容內容蛋白質組學可分為三個主要領域：1、蛋白質的微特性以供蛋白質的規(guī)?；b定和他們的后翻譯飾；2、“差異顯示”蛋白質組學供蛋白質水平與疾病在廣泛范圍的有力應用比較；3、應用特定的分析技術如質譜法（包括串聯(lián)質譜法、生物質譜法）或酵母 雙雜交系統(tǒng)以及其他蛋白質組學研究新技術研究蛋白質-蛋白質相互作用。研究技術3蛋白質分離策略：1、多維色譜法，包括大小排阻色譜法、離子交換色譜法、反相高效色譜法、疏水性相互作用色譜法等；2、多維電泳技術，包括二維凝膠電泳法、自由流動電泳法、毛細管區(qū)帶電泳法等；3、親合法，包括免疫印跡法、親和捕獲；4、細胞器，膜的復合體分離。二維凝膠電泳法： 二維凝膠電泳的原理

3、是第一向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。 2-DE有較好的分辨率，SDS-PAGE或單相IEF的最好分辨率僅為100個蛋白，而2-DE大約為3000個蛋白。蛋白質肽段的鑒定:1、氨基和羧基末端分析，如：Edman2、質譜法，包括肽片段的質譜和串聯(lián)質譜法、質譜法： 質譜（mass spectrum）是化合物分子在真空條件下受電子流的轟擊或強電場等其他方法的作用，電離成離子，同時發(fā)生某些化學鍵有規(guī)律的斷裂，生成具有不同質量的帶電荷的離子，這些離子按質荷比m/z（離子的質量m與其所帶電荷z的比值）的大小被

4、收集并記錄程譜的方法。 生物質譜技術是蛋白質組學研究中最重要的鑒定技術，其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的荷質比（M/E）的差異來分離并確定分子量。對于經過雙向電泳分離的目標蛋白質用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對這些肽段用質譜進行鑒定與分析。目前常用的質譜包括兩種：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質譜（ESI- MS）。 蛋白質相互作用1、免疫共沉淀技術： 該技術以抗體和抗原之間的特異性結合為基礎，不僅能夠確定生理條件下細胞或組織內2種目標蛋白質是否存在相互作用，還可以探究與己知相互作用的蛋白。 它的基本原理是

5、在非變性條件下裂解細胞，保留細胞內相互作用的蛋白質，將目的蛋白的抗體加入細胞裂解液中，使目的蛋白在體內的相互作用蛋白成電下來。經過洗脫，收集沉淀物并進行分離，最后對分離所獲得蛋白進行鑒定。 該方法所研究的蛋白均是在體內經過翻譯后修飾的，并且是可分離的天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物，能夠反映正常生理條件下的蛋白質間相互作用蛋白質相互作用2、酵母雙雜交系統(tǒng)： 該系統(tǒng)利用真核細胞調控轉錄起始過程中，DN A結合結構域(binding domain,BD)識別DNA上的特異序列并使轉錄激活結構域(activation domain, AD)啟動所調節(jié)的基因的轉錄這一原理，將己知蛋白X和待研究蛋白Y的基因

6、分別與編碼AD和BD的序列結合，通過載體質粒轉入同一酵母細胞中表達，生成兩個融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，則AD和BD在空間上接近就能形成完整的有活性的轉錄因子，進而啟動轉錄，表達相應的報告基因;反之，如果X和Y之間不存在相互作用，報告基因就不會表達。這樣，通過報告基因的表達與否，便可確定是否發(fā)生了蛋白質的相互作用。蛋白質相互作用3、蛋白質芯片技術 蛋白質芯片是一種新型的生物芯片，能夠進行高通量的蛋白功能分析。該技術實現(xiàn)的基礎是蛋白探針在固相支持物(載體)表而的大規(guī)模集成，利用樣品中標記或未經標記的靶蛋白分子與探針進行反應，然后通過熒光法、放射性同位素法或無標記檢測法等相應的方法進行檢測

7、，最后由計算機分析結果，獲得高豐度表達蛋白。蛋白質組學的應用 疾病研究 植物學 藥物研究 食品科學 遺傳病學 微生物學在疾病及藥物研究中的應用 1.發(fā)現(xiàn)新的疾病標志物，鑒定疾病相關蛋白質作為早期臨床診斷標志。 例如：Lei等通過2-DE和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜等蛋白質組學相關技術對膀胱癌患者的尿蛋白進行分離鑒定，獲得14個差異表達的蛋白質，這些差異表達的蛋白可能是診斷和檢測膀胱癌的潛在尿標志物。在疾病及藥物研究中的應用 2.探索疾病的發(fā)病機制和治療途徑。 例：Polprasert等應用蛋白質組學方法對遺傳性球形紅細胞增多癥的紅細胞膜蛋白變化進行研究，分離鑒定出56個差異表達的蛋白質，

8、通過蛋白質網(wǎng)絡分析出包括細胞死亡、細胞循環(huán)及遺傳性和血液性紊亂3個HS相關的重要網(wǎng)絡，為進一步研究和了解HS相關的發(fā)病機制提供了參考。在疾病及藥物研究中的應用 3.研究膜蛋白及膜相關蛋白 Liu等利用比較膜蛋白組學方法對H5N1病毒分別感染6,12,14h的人肺腺癌細胞A549進行蛋白分析鑒定，得到24個差異表達的蛋白質，其中57%為膜蛋白或膜相關蛋白，通過siRNA技術鑒定出與病毒增殖相關的幾種蛋白質。在疾病及藥物研究中的應用 4、為快速，特異，高通量的藥物研究提供了技術支持。 Lin等應用蛋白質組學技術對阿霉素處理的人子宮癌細胞的蛋白表達變化進行研究發(fā)現(xiàn)，有 37 種差異表達的蛋白質，為阿

9、霉素抗性的子宮癌細胞的治療提供了診斷和治療標志物。蛋白質組學的研究技術 蛋白質分離技術：雙向凝膠電泳（2DE），雙向熒光差異電泳（2D-DIGE），等電聚焦電泳（IEF）,液相色譜。 多維色譜（MDC），多維液相色譜（MDLC） 蛋白質鑒定技術一級質譜：根據(jù)離子源的不同，分為基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質譜（ESI- MS）。二級質譜： 肽質量指紋圖譜（PMF）。新技術：穩(wěn)定同位素特征標簽生物質譜(SIAMS) iTRAQ 定義：定義：同位素標記相對和絕對定量同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and abs

10、olute quantitation，iTRAQ) 技術由AB SCIEX公司研發(fā)的一種體外同種同位素標記的相對與絕對定量技術。該技術利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團，經高精度質譜儀串聯(lián)分析，可同時比較多達8種樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術。原理：原理：iTRAQ 技術采用4種或8種同位素編碼的標簽同位素編碼的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，而后進行串聯(lián)質譜分析串聯(lián)質譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量或絕對含量。iTRAQ試劑試劑 iTRAQ試劑是一種小分子同重元素化學物質，包括三部分： 1.一端是報告部分 repo

11、rter group 2.另一端是肽反應部分 peptide reactive group 3.中間部分是平衡部分 balance group reporter group：質量為114Da、115 Da、116 Da、117Da，因此iTRAQ試劑共四種； peptide reactive group：將reporter group與肽N端及賴氨酸側鏈連接，幾乎可以標記樣本中所有蛋白質； balance group：質量為31 Da、30 Da、29 Da、28 Da，使得四種iTRAQ試劑分子量均為145 Da，保證iTRAQ標記的同一肽段m/z相同。 iTRAQ 試劑結構 iTRAQ 試

12、劑標記原理 4個來源不同的相同蛋白樣品在一級質譜上表現(xiàn)相同; Balance group在二級質譜發(fā)生中性丟失; Reporter group 在二級質譜產生個報告離子，分別是114、115、116和117; 通過分析報告離子的峰強度比值就可以分析同一個蛋白在不同樣品間的表達量比值. 操作流程操作流程儀器儀器TripleTOFTM5600+系統(tǒng)是快速評估藥物代謝穩(wěn)定性、藥物在體內特征和最終代謝產物鑒定的理想平臺。在最快采集速度條件下，用高分辨和準確質量質譜數(shù)據(jù)，完成無與倫比的蛋白質定性鑒定工作。 技術特點技術特點定量精確：定量精確：每組平行比較多達8個樣本，標記效率高達97%，可減少樣本處理、

13、以及不同組上機造成的實驗誤差。高效率樣品分離：高效率樣品分離：進行SCX-HPLC分離，實現(xiàn)自動化操作。高鑒定率：高鑒定率：系統(tǒng)全面地研究組織或細胞中盡可能多的蛋白質，可鑒定多達6000種蛋白。適用范圍廣：適用范圍廣：無物種特異性限制，理論上可用于所有物種。iTRAQ技術不僅可發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。儀器性能優(yōu)良：儀器性能優(yōu)良：基于高分辨率（大于105）、高質量精度（小于1ppm）質譜平臺，可獲得更加準確的結果。iTRAQ技術可檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。熒光差異凝膠電泳原理 在二維電泳的基礎上進行熒光標記特點 DIGE熒光差異蛋白表達

14、分析系統(tǒng)在傳統(tǒng)雙向電泳技術的基礎上，結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，并第一次引入了內標的概念，極大地提高了結果的準確性，可靠性和重復性。在DIGE技術中，每個蛋白點都有它自己的內標，并且軟件全自動根據(jù)每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE技術可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達差異，統(tǒng)計學可信度達到95%以上。實驗流程實驗流程儀器 熒光差異凝膠電泳系統(tǒng)Ettan DIGE 2D試劑1.樣品標記（1）染料 Cy2,Cy3,Cy5 與蛋白的賴氨酸的epsilon-氨基反應，產生三種帶正電荷的熒光基團，在不同波長光激發(fā)下產生熒光。 2.一相等點聚焦（2）IPG膠條水化液（3）分離膠緩沖液（4）平衡緩沖液（5） 溴酚藍