骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離分化及研究進(jìn)展

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離分化及研究進(jìn)展摘要:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓基質(zhì)中的非造血系細(xì)胞,它們能夠分化成中胚層和非中胚層細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要有4種體外分離方法:貼壁篩選法,密度梯度離心法,流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠分離法。由于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞具有多方面的優(yōu)勢,越來越受到人們的關(guān)注,研究也越來越深入。本文從來源、形態(tài)、體外分離培養(yǎng)及應(yīng)用前景幾個方面做一綜述,為相關(guān)研究提供參考。關(guān)鍵詞:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;分離培養(yǎng);分化骨髓由造血組織和基質(zhì)構(gòu)成,近年的研究表明,在骨髓基質(zhì)中存有間質(zhì)干細(xì)胞(me5enchyma15temcel15,MSCS,骨髓原始間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,對骨髓中的造血干

2、細(xì)胞(HSC不僅有機(jī)械支持作用,還能分泌多種生長因子(如IL-6,IL-11,LIF,M-CSF及SCF等來支持造血,體內(nèi)外實(shí)驗已證明它具有多向分化潛能,在一定的誘導(dǎo)條件下MSCS具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肌鍵細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等中胚層細(xì)胞分化的能力。因此它已成為醫(yī)學(xué)界近來研究的熱點(diǎn),但骨髓中MSCS含量很少,每1萬10萬個單核細(xì)胞中大約有1個MSCS,難以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要,因此體外分離純化MSCS,研究其培養(yǎng)特性,獲得大量穩(wěn)定的MSCS具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。1. 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的來源在生物個體的發(fā)育過程中先后出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞,具有多向分化潛能的間質(zhì)干細(xì)胞作為一種成

3、體干細(xì)胞來源于中胚層間充質(zhì),主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富,在人的骨髓中約占單個核細(xì)胞數(shù)的1/11051。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類貼壁基質(zhì)細(xì)胞,可以向間質(zhì)組織分化,包括骨組織,軟骨組織,脂肪組織。目前研究較多的間質(zhì)干細(xì)胞主要來源于臍帶血、外周血及脂肪組織。MSCS的獲得主要來自于骨髓的抽吸,人類MSCS一般從髂前上棘吸取,也可從脛骨、股骨、胸骨、腰椎等骨中獲取,大動物MSCS的獲取部位與人類相同,兔需抽取中段脛骨或股骨的骨髓。2. 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)體外培養(yǎng)的MSCS體積小,成梭形或多角形,核漿比大,多為平行排列生長或漩渦狀生長,部分貼壁細(xì)胞可以快速形成集落,一些

4、呈典型的紡錘形樣的MSCS增殖迅速,形態(tài)均一。細(xì)胞傳代后,傳代細(xì)胞較原代細(xì)胞的貼壁速度快,細(xì)胞傳到第3代時細(xì)胞形態(tài)比較一致。在光鏡和相差顯微鏡下,MSCS為長梭形,類似成纖維細(xì)胞外觀。透射電鏡下MSCS可表現(xiàn)為兩種不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)類型:一種是處于相對靜息狀態(tài)的細(xì)胞,核較大,核質(zhì)比大,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器少;另一種是處于相對活躍期細(xì)胞,細(xì)胞體積大于前者,核不規(guī)則,含23個核仁,核質(zhì)比小,胞質(zhì)中有豐富的細(xì)胞器。3. 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外分離方法體外從骨髓分離獲得的方法主要有貼壁法,密度梯度離心法,流式細(xì)胞術(shù)和免疫磁珠分離法2,但更理想的分離純化方法還有待于進(jìn)一步的摸索。貼壁篩選法是利用細(xì)胞貼壁時間及貼壁牢固

5、性的不同逐步將非貼壁細(xì)胞和其它雜質(zhì)細(xì)胞去除的一種簡單易行的培養(yǎng)MSCS的方法。貼壁分離培養(yǎng)法分離的MSCS能在體外培養(yǎng)條件下生長良好、可連續(xù)傳代,體外培養(yǎng)擴(kuò)增能力較強(qiáng),其缺點(diǎn)是細(xì)胞純度較低3。此方法簡便,沖出骨髓直接培養(yǎng),然后利用骨髓MSCS貼壁生長特性,更換培養(yǎng)液逐步去處漂浮生長的造血系細(xì)胞即可獲得較純化的MSCS;而且骨髓中的造血干細(xì)胞能分泌生長因子和促貼壁物質(zhì),可促進(jìn)MSCS貼壁生長,因此全骨髓貼壁法更為可取。密度梯度離心法梯度離心法的核心主要是基于密度梯度離心技術(shù)。梯度離心法是根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分的比重不同,使用淋巴細(xì)胞分離液提取單個核細(xì)胞,再進(jìn)行貼壁培養(yǎng),從而達(dá)到分離、純化MSCS的目

6、的。Pittenger等的研究發(fā)現(xiàn)通過密度梯度離心分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在第一代時純度可以達(dá)到95%4。常用的分離方法免疫磁珠法,是利用免疫學(xué)的技術(shù)分離MSCS,分離細(xì)胞的純度高。Phinney5用一種免疫耗損技術(shù)精確地將造血細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞系從基質(zhì)細(xì)胞中分離出來,提供了一種能高效的分離純化間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,但目前仍未篩選到真正特異性的細(xì)胞表面標(biāo)記;而且,這兩種分離方法的操作對細(xì)胞活性都有較大影響,造成MSCS損傷,出現(xiàn)增殖緩慢等問題,這些技術(shù)問題很大程度上限制了這兩種方法的應(yīng)用。因此,如何能簡便高效地獲得均質(zhì)性的間充質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)胞群仍需要繼續(xù)探索。分離細(xì)疫磁珠分離和流式細(xì)胞儀篩選的方法,不

7、僅對細(xì)胞活性影響較大,而且操作復(fù)雜,價格昂貴。然而,這些純化間充質(zhì)干細(xì)胞的方法比較復(fù)雜,一般僅限于在各自的實(shí)驗室應(yīng)用。因此,如何能簡便高效地獲得均質(zhì)性的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞群仍需要繼續(xù)探索。4.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分化現(xiàn)在的研究揭示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有分化成多種細(xì)胞的潛能6,包括心肌細(xì)胞7、肝細(xì)胞8、腦中的神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞等。在心肌細(xì)胞方向分化方面,Fukuda9研究發(fā)現(xiàn)鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在5-氮雜包苷作用下,干細(xì)胞形成肌管狀結(jié)構(gòu)并有明顯的細(xì)胞之間的交互作用,開始可自發(fā)搏動,最終可以同步搏動,從而說明了間充質(zhì)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞。其他一些研究人員研究表明人胚胎干

8、細(xì)胞體外可以分化為不僅具有心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)而且還同時具有功能的肌細(xì)胞10。有學(xué)者用免疫磁珠法分選純化得到小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞,雙苯甲亞胺和溴脫氧核苷標(biāo)記后注入新生小鼠側(cè)腦室。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷徙到紋狀體、海馬中,并在該處分化為成熟的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在腦干的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)表達(dá)神經(jīng)絲的供體細(xì)胞,提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元。Verfaillie 11在體外成功地誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,同時證明誘導(dǎo)分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞具有成熟內(nèi)皮細(xì)胞的功能,在人工基底膜上可形成血管結(jié)構(gòu)。實(shí)驗說明在適宜條件下間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換,可以在體外誘導(dǎo)擴(kuò)增后作為血管內(nèi)皮細(xì)胞移植供體用于血管疾病治療。5.骨髓間質(zhì)干細(xì)

9、胞的應(yīng)用前景骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞,具有較強(qiáng)的可塑性,在體內(nèi)外特定條件下可向成骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、皮膚和肝等多種類型的成熟細(xì)胞分化12,同時MSCS還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用。由于MSCS具有來源方便、擴(kuò)增迅速、可塑性強(qiáng)、離成熟細(xì)胞近和多向分化潛能,而且還可以實(shí)現(xiàn)個體化治療、無免疫排斥問題和倫理之爭等,因此是最具有臨床應(yīng)用優(yōu)勢的種子細(xì)胞,在創(chuàng)傷修復(fù)、組織或器官重建、退行性疾病、遺傳性疾病、抗腫瘤、抗衰老等方面具有廣闊的應(yīng)用前景13。近年來,研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞還具有特異性向腫瘤組織遷移的特性,因此有人將其作為基因治療細(xì)胞載體攜帶Interferon-14治療基因、溶瘤病毒15靶向到達(dá)

10、腫瘤局部,殺傷腫瘤細(xì)胞。最新的研究更是發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加,MSCS與纖維母細(xì)胞表面抗原的差異會減小,并且用于檢測的一些抗體如CD105、CD166、CD90、CD44、CD29、CD73等也表達(dá)于肺或者皮膚的纖維母細(xì)胞16 。5.結(jié)論MSCS這個概念是由Friedenstein和他的同事在40多年前提出的17。隨后的研究發(fā)現(xiàn)其具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱及骨髓間質(zhì)等多種間充質(zhì)組織分化的潛能18,近來又有研究發(fā)現(xiàn)MSCS與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要的聯(lián)系。因此,如何培養(yǎng)出高純度、穩(wěn)定的MSCS,是進(jìn)行更深一步研究的基礎(chǔ)。盡管較多的動物實(shí)驗、臨床前期實(shí)驗和資料表明,MSCS在治療上具有安全性

11、和有效性,但仍然存在其環(huán)境作用和調(diào)控機(jī)制等方面的問題,諸如與治療相關(guān)的細(xì)胞移植、移植物移入、歸位和體內(nèi)的分化等仍需進(jìn)一步研究。干細(xì)胞治療的廣泛運(yùn)用必須依賴于有效的、大規(guī)模的培養(yǎng)、儲存,而支架對其運(yùn)用也起著相當(dāng)重要的作用。在過去干細(xì)胞研究中對MSCS生物學(xué)特性已有了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識,這對其運(yùn)用于臨床治療提供了堅實(shí)基礎(chǔ),隨著對其特性的不斷揭示,MSCS在臨床治療應(yīng)用有著理想前景。參考文獻(xiàn):1 FRIEDENSTEIN A J, PETRAKOV A K V, KUROLESOV A A I,et a.l Heterotopic ofbonemarrow Analysis ofprecursor cell

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