間充質干細胞體內(nèi)成骨的實驗研究

1、間充質干細胞體內(nèi)成骨的實驗研究 08-07-02 11:38:00 編輯：studa20 作者：李章華，彭昊，廖文，張玉富，趙強，王常勇 【關鍵詞】 組織工程化骨摘 要：目的探討間充質干細胞在體內(nèi)的成骨能力。方法從羊髂嵴處抽取1015 ml骨髓組織，用Percoll分離液按梯度離心法分離出間充質干細胞，培養(yǎng)、增殖后種植在多孔磷酸三鈣上，構建組織工程化骨，植入8只羊的左后肢跖骨缺損區(qū)（長21 mm）作為實驗組；單純植入多孔磷酸三鈣陶瓷材料的8只羊作為對照組；分別在術后6、12、24周處死動物行放射學、組織學和生物力學檢測。結果放射學和組織學檢測，術后6周實驗組即可見有新骨生成，對照組則無明顯新骨

2、生成；骨缺損部位新生骨樣組織、編織骨和板狀骨出現(xiàn)的時間實驗組也都較對照組早，并且不經(jīng)軟骨介導即能直接成骨，而對照組從兩端以“爬行替代”方式成骨。術后24周，放射學和生物力學檢測顯示實驗組骨缺損幾乎完全修復，對照組只有部分愈合。結論間充質干細胞不僅在體外具有良好的增殖能力，回植入體內(nèi)后仍然具有良好的成骨能力，不需經(jīng)過軟骨過程就能直接形成新骨，顯示了間充質干細胞作為骨組織工程種子細胞良好的應用前景。 關鍵詞：組織工程化骨； 骨缺損； 新生骨； 間充質干細胞 Abstract：ObjectiveTo investigate the osteogenic ability in vivo of mese

3、nchymal stem cells（MSCs）MethodTenfifteen ml bone marrow aspirates were harvested from the iliac crest of sheep and enriched for MSCs by density gradient centrifugation over a Percoll cushion（1073 g/ml）After cultured and proliferated,the tissueengineered bones were constructed with these cells and se

4、eded onto porous 13tricalcium phosphate ceramics（13TCP）Then,the constructs were implanted into left metatarsus defect（21 mm in length）of 8 sheep as an experimental groupPorous TCP composed with bone marrow was implanted into defects of same size and position in 8 sheep as a control groupSheep were s

5、acrificed in the 6th,12th,and 24th week postoperatively,and the implanted samples were examined by radiograph,histology,and biomechanical analysisResultNew bone tissue was observed either radiographically or histologically at the defect area of experimental group as early as the 6th week postoperati

6、vely;but was not observed in the control groupBecause of the new bone formed in a direct manner without progression through a cartilaginous process intermediately,osteoid tissue,woven bone and lamellar bone,occurred earlier in the experimental group than in the control group,in which the bone defect

7、s were repaired in a “creep substitution” mannerAt the 24th week,radiographs and biomechanical tests revealed an almost complete repair of the defect in experimental group,but only a partial repair in the control groupConclusionMSCs have good reproductive activity not only in vitro,but also in vivoT

8、he new bone formed in a direct manner without progression through a cartilaginous process intermediately when MSCs were transplanted in vivoThe results demonstrated that MSCs was an excellent seed cells for bone tissue engineering Key words：Tissueengineered bone; Bone defect; Regenerated new bone; M

9、esenchymal stem cells 迄今為止，大節(jié)段的骨缺損修復仍然是骨科醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的自、異體骨移植法都有一定的局限性，因此有必要尋找一種新的修復骨缺損的方法。多孔磷酸三鈣陶瓷具有良好的生物降解性、生物相容性，而且無毒性，結構穩(wěn)定并適合細胞生長，因而是骨組織工程理想的支架材料1。然而，為了增加材料的生物活性還需要增加一些刺激骨生長的物質，包括骨髓、干細胞、成骨細胞、骨形態(tài)蛋白等。骨髓細胞中包括有造血干細胞和具有成骨潛能的間充質干細胞，這種干細胞具有多向分化潛能，故而能分化為骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪和造血基質等多種組織。本研究的目的就是探討間充質干細胞在體內(nèi)的成骨能力。

10、1 材料與方法 11 材 料 111 實驗用品 LDMEM（Gibco，BRL，USA），胎牛血清（FCS，Gibco，BRL，USA），其它化學用品均購自Sigma公司。多孔磷酸三鈣陶瓷由法國地中海大學盧建熙博士提供，呈圓柱狀，長21 mm，直徑10 mm，孔隙率70，孔徑（45050）m，連接徑（15050）m，射線消毒，劑量25KGY。 112 動 物 成年綿羊16只，年齡（205）歲，體重（3510）kg。術前予以標準的動物飼料和流動水。將動物隨機均分成兩組：第1組，磷酸三鈣陶瓷植入組;第2組，磷酸三鈣陶瓷與自體間充質干細胞復合植入組。 12 方 法 121 分離、培養(yǎng)間充質干細胞 在

11、全麻、無菌條件下，用18號穿刺針從羊髂嵴處抽取1015 ml新鮮骨髓，肝素抗凝（200 UmL）。為了防止穿刺時骨髓被血液稀釋，應分別在髂嵴上不同的3個點進行穿刺。按照前述的方法分離、培養(yǎng)間充質干細胞2。首先把骨髓與含10 FCS的LDMEM培養(yǎng)基混合，培養(yǎng)基中含青、鏈霉素（100 UmL），細胞計數(shù)后用Percoll分離液（1073 gmL）梯度分離間充質干細胞。收集界面層細胞，洗滌后種植在75 cm75 cm的培養(yǎng)瓶中，每瓶含細胞1106個。然后將它培養(yǎng)在37 ，5 CO2和100濕度的孵箱中。第3 d換液，去除不貼壁的細胞，以后每周更換培養(yǎng)液2次。在第9、10或11 d時以8103個mL

12、的密度傳代，直至培養(yǎng)的第16 d。 122 構建多孔磷酸三鈣陶瓷與細胞復合體 在培養(yǎng)的第16 d用胰酶和乙二胺四乙酸消化細胞，收集、重懸，調(diào)整細胞濃度至1108個mL（骨形成所需的標準起始細胞濃度），將細胞懸液均勻地滴加在磷酸三鈣陶瓷材料上即成為陶瓷-細胞復合體。復合體先在37 、5 CO2和100濕度的孵箱中干孵育6 h，然后再加入含15 FCS的LDMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。 123 手術過程 手術在全麻、無菌條件下進行，手術過程與文獻報道相同3。術區(qū)脫毛、消毒，外側正中切口切開皮膚和軟組織，鈍性剝離骨膜，用線鋸在跖骨中段鋸取21 mm長的跖骨干缺損，包括附著在骨干上的骨膜。無菌生理鹽水沖洗骨缺損區(qū)，加壓鋼板固定，按實驗要求植入材料，逐層縫合。術后頭2 d動物放置在空調(diào)室內(nèi)，禁止負重，2 d后開放性圈養(yǎng)，允許其在疼痛可忍受的程度下活動，羊飼料和流動水飼養(yǎng)。術后6、12、24周處死動物取材。 124 熒光標記 分別在處死前15 d和前7 d連續(xù)皮下注射四環(huán)素3 d，劑量50mgkg。 125