豬瘟抗體檢測(cè)

1、豬瘟抗體豬瘟抗體ELISA檢測(cè)檢測(cè) 2015年年12月月提提 綱綱13254豬瘟抗體檢測(cè)豬瘟抗體檢測(cè)ELISA原理原理ELSA基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)操作過程操作過程實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)一、ELISA概念及類型 50年代的免疫熒光（年代的免疫熒光（IFA）和）和60年代的放射性免疫年代的放射性免疫（RIA）分析技術(shù)之后，）分析技術(shù)之后，70年代初又建立了用酶來年代初又建立了用酶來標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù) 1971年此項(xiàng)技術(shù)由瑞典學(xué)者年此項(xiàng)技術(shù)由瑞典學(xué)者 Engvall 和和Perlmann，荷蘭學(xué)者荷蘭學(xué)者Van Weeman和和 Schuurs分別報(bào)道，將免疫

2、分別報(bào)道，將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（法，稱為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA） ELISA的原理的原理 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面

3、的抗原或抗體起反應(yīng)體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分

4、的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。在在ELISA方法中有三個(gè)必要的方法中有三個(gè)必要的試劑試劑： （1）固相的抗原或抗體，即）固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑免疫吸附劑”（immunosorbent）；）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物結(jié)合物”（conjugate）；）； （3）酶反應(yīng)的底物。）酶反應(yīng)的底物。幾種常用的幾種常用的ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)方法 雙抗體夾心法測(cè)抗原（常用）雙抗

5、體夾心法測(cè)抗原（常用） 夾心法夾心法 雙抗原夾心法測(cè)抗體雙抗原夾心法測(cè)抗體 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 捕獲包被法測(cè)抗體捕獲包被法測(cè)抗體 親和素親和素-生物素生物素 ELISA法法間接法測(cè)抗體（常用）間接法測(cè)抗體（常用）二、豬瘟抗體檢測(cè)二、豬瘟抗體檢測(cè)ELISA實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 包被板上包被的豬瘟包被板上包被的豬瘟(CSF)抗原，可與待測(cè)樣品中抗原，可與待測(cè)樣品中的特異性抗體（抗的特異性抗體（抗-CSFV）反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)）反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物被吸附到固相上，再加入酶標(biāo)記的抗豬合物被吸附到固相上，再加入酶標(biāo)記的抗豬IgG，形成形成“固相豬瘟病毒抗原

6、固相豬瘟病毒抗原-豬瘟病毒抗體豬瘟病毒抗體-抗豬抗豬IgG-HRP”免疫復(fù)合物，洗滌后，如待測(cè)樣品中含有豬免疫復(fù)合物，洗滌后，如待測(cè)樣品中含有豬瘟抗體，加入顯色液即顯色，為陽性；反之為陰性。瘟抗體，加入顯色液即顯色，為陽性；反之為陰性。三、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備三、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 常用儀器常用儀器 洗滌液配置：濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水25倍稀釋。 用CSFV樣品稀釋液20倍稀釋待檢樣品 使用前所有試劑盒組分應(yīng)恢復(fù)到18-26，并震蕩混勻。四、豬瘟四、豬瘟ELISA操作過程操作過程 1、移板：在、移板：在CSF抗原包被板上加入抗原包被板上加入各各100vl陰、陽性陰、陽性對(duì)照，陰陽性對(duì)照對(duì)照，陰陽性對(duì)照設(shè)復(fù)

7、空。在相應(yīng)空設(shè)復(fù)空。在相應(yīng)空中加入中加入100vl已稀已稀釋好的樣品，封板釋好的樣品，封板37溫育溫育30min。2、洗板，棄去各空液體，280vl/孔已稀釋洗滌液洗滌板空，共洗5次，每次洗滌后棄孔內(nèi)液，最后一次將板空洗滌液拍干。3、加酶結(jié)合物，每孔100vl，封板37溫溫育育30min。4、重復(fù)步驟2洗板。5、每孔加入50vl顯色A液和50vl顯色B液（也可A、B顯色液等比例混合后加入100vl），封板37溫育溫育10min。6、每孔加入50vl終止液，終止反應(yīng)。7、測(cè)量并記錄樣品和對(duì)照的OD值（450nm）結(jié)果分析結(jié)果分析1、實(shí)驗(yàn)成立條件、實(shí)驗(yàn)成立條件 陰性對(duì)照值陰性對(duì)照值=（NC1+NC

8、2）/2 陽性對(duì)照值陽性對(duì)照值=（PC1+PC2）/2 實(shí)驗(yàn)成立條件：陽性對(duì)照平均值實(shí)驗(yàn)成立條件：陽性對(duì)照平均值-陰性對(duì)照平均值陰性對(duì)照平均值0.1，陰，陰性對(duì)照平均值性對(duì)照平均值0.1。2、結(jié)果判定、結(jié)果判定 樣品計(jì)算樣品計(jì)算 S/P=(樣品樣品-陰性對(duì)照平均值）陰性對(duì)照平均值）/（陽性對(duì)照平均值（陽性對(duì)照平均值-陰性對(duì)照平均值）陰性對(duì)照平均值） S/P值值0.4,樣品判定為樣品判定為CSFV抗體陽性?？贵w陽性。 S/P值值0.4,樣品判定為樣品判定為CSFV抗體陰性?？贵w陰性。五、注意事項(xiàng)五、注意事項(xiàng) 1、基本操作注意事項(xiàng)、基本操作注意事項(xiàng) 加樣加樣: : 在在ELISA中一般有中一般有3

9、次加樣步聚，即加樣本，加酶結(jié)次加樣步聚，即加樣本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 1、基本操作注意事項(xiàng)、基本操作注意事項(xiàng) 保溫保溫: : 抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(或孵育incubation)。 ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？ 以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液

10、中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 1、基本操作注意事項(xiàng)、基本操作注意事項(xiàng) 洗滌洗滌: :洗滌在洗滌在ELISAELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIAELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)

11、。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。下來?？梢哉f在可以說在ELISAELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。 1、基本操作注意事項(xiàng)、基本操作注意事項(xiàng) 顯色顯色: : 顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈內(nèi)，陰性孔可保

12、持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。 TMBTMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后，約作用后，約4040分鐘顯分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2 2小時(shí)后即可完全消退至無小時(shí)后即可完全消退至無色。色。 1、基本操作注意事項(xiàng)、基本操作注意事項(xiàng) 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀: : 酶標(biāo)比色

13、儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.0010.001，準(zhǔn)確，準(zhǔn)確性為性為1%1%，重復(fù)性達(dá)，重復(fù)性達(dá)0.5%0.5%。 操作時(shí)室溫宜在操作時(shí)室溫宜在15-3015-30，使用前先，使用前先預(yù)熱儀器預(yù)熱儀器15-3015-30分鐘分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如本實(shí)驗(yàn)用吸收峰，如本實(shí)驗(yàn)用450nm450nm波長(zhǎng)。有的