黃曲霉毒素的測(cè)定ELISA法

1、黃曲霉毒素的測(cè)定ELISA法測(cè)試前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明在28冷藏不要凍結(jié)1.簡(jiǎn)介 黃曲霉毒素黃曲霉毒素是一種劇毒且致癌的物質(zhì)，它是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌A的某些菌株產(chǎn)生的。黃曲霉毒素有四種類型：B1，B2，G1和G2。黃曲霉毒素B1是毒性最大且最常有的。最容易產(chǎn)生黃曲霉毒素污染的物質(zhì)是谷物、花生、棉子、高梁和大多數(shù)的樹果。動(dòng)物食入過量黃曲霉毒素的影響從慢性健康直到死亡，已經(jīng)證明黃曲霉毒素能引起肝損壞或癌癥、降低奶和蛋的產(chǎn)出、免疫抑制和干擾再生效率。美國食品藥物管理局已經(jīng)規(guī)定了食品和飼料中最大黃曲霉毒素限量。因此，準(zhǔn)確測(cè)定黃曲霉毒素的含量，對(duì)于監(jiān)測(cè)可能發(fā)生黃曲霉毒素污染的食品和飼料的質(zhì)量來說，是非常

2、重要的。測(cè)試程序包括仔細(xì)的采樣、化學(xué)提取、衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)和定量分析。美國食品藥物管理局已經(jīng)頒布的黃曲霉毒素限量如下：適用對(duì)象限量物質(zhì)人20ppb除牛奶外的所有食品所有動(dòng)物20ppb所有飼料（下列除外）除外：種牛，種豬，成熟的家禽100ppb谷物育肥期的豬（100磅）200ppb谷物育肥期的菜牛300ppb谷物育肥期的菜牛、豬、家禽300ppb棉籽粉2.方法原理本測(cè)試盒的測(cè)試原理是一種競(jìng)爭(zhēng)性的直接酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)試方法（ELISA），可準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中ppb級(jí)的黃曲霉毒素。樣品和標(biāo)準(zhǔn)控制液中游離的黃曲霉毒素與軛合物中的黃曲霉毒素競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位置。清洗后，加入底物，底物與軛合物反應(yīng)出現(xiàn)蘭色，蘭色越深表

3、明黃曲霉毒素越少。將其置于微型孔閱讀器中可讀出透光度，以控制標(biāo)準(zhǔn)液的透光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的透光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計(jì)算出樣品中黃曲霉毒素的準(zhǔn)確濃度。 3.貯存要求本試劑盒存放在28時(shí)，可以一直使用到標(biāo)簽上注明的到期日期。4.試劑與儀器4.1提供的材料48個(gè)包被了抗體的孔；48個(gè)紅色標(biāo)記的混合孔；4瓶1.5ml濃度為0、5、15、50ppb黃曲霉毒素控制標(biāo)準(zhǔn)液(黃色標(biāo)簽)（甲醇溶液的處理，見注意事項(xiàng)）；1瓶7ml黃曲霉毒素-HRP軛合物溶液(蘭色標(biāo)簽)；1瓶24mlK蘭底物溶液(綠色標(biāo)簽)；1瓶32ml紅色 (紅色標(biāo)簽)。4.2需要但未提供的材料70%甲醇溶液；100ml量筒；150ml的具塞三

4、角瓶；濾紙；樣品收集具塞試管；漏斗；粉碎機(jī)；稱量為525克的秤；帶450nm濾光片的酶標(biāo)儀；200l移液器；200l吸咀；紙巾或等效的吸水材料；計(jì)時(shí)器；防水記號(hào)筆；洗瓶；移液器用的試劑槽；蒸餾水或去離子水；12通道移液器5.注意事項(xiàng)甲醇易燃，其容器應(yīng)密閉并遠(yuǎn)離熱、火花、明火和煙。如果吞下或吸入蒸氣，它是有毒的。應(yīng)避免與皮膚接觸。本測(cè)試盒不使用時(shí)應(yīng)在28下存放。不要使用過期的測(cè)試盒。不要把不同測(cè)試盒中的試劑混合使用。遵守正確的移液技術(shù)，包括取液前先用該液潤洗一次。放置時(shí)間與本說明不一致時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。測(cè)試盒應(yīng)先恢復(fù)到室溫狀態(tài)(1830)后才開始使用。避免測(cè)試盒在室溫下長時(shí)間放置。不要使

5、測(cè)試盒凍結(jié)。應(yīng)將包括樣品提取液在內(nèi)的所有廢液和實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行處理（如同已被黃曲霉毒素污染一樣）。應(yīng)始終穿戴手套和其它防護(hù)服。為了避免交叉污染，每個(gè)樣品應(yīng)使用清潔的吸咀和玻璃器皿，并在樣品之間徹底清洗所有的玻璃器皿。待測(cè)樣品的pH值應(yīng)為68。酸堿過大的樣品應(yīng)進(jìn)行調(diào)整。關(guān)于pH值的調(diào)整，請(qǐng)技術(shù)服務(wù)部門聯(lián)系。每次試驗(yàn)不要超過24孔。6.程序性的提示K-蘭底物隨時(shí)可用，底物為清亮的淺蘭色，如果變成了深蘭，則棄去。使用時(shí)，只倒出所需量到試劑槽中，未用完的不要再倒回試劑瓶中。不使用時(shí)應(yīng)蓋住試劑槽，以避免光的照射。7.操作步驟7.1樣品制備和提取待測(cè)樣品應(yīng)按公認(rèn)的采樣技術(shù)采集。樣品應(yīng)磨碎并充分混合后再提取。測(cè)

6、試前，將樣品在28存放。按以下程序進(jìn)行：1 將7份分析級(jí)甲醇與3份蒸餾水或去離子水混合配成70%的甲醇溶液。取1份代表性樣品。研磨樣品至至少有75%的樣品通過20目的篩子，顆粒尺寸大約相當(dāng)于細(xì)的速溶咖啡。把5克研磨過的樣品加入到25ml 70%的甲醇中，然后用力搖動(dòng)15分鐘。用濾紙過濾出至少5ml的提取液。該濾液即為樣品的待測(cè)液。該待測(cè)液即可用于測(cè)試。7.2測(cè)試程序測(cè)試前應(yīng)將所有的試劑恢復(fù)至室溫（1830）。7.2.1從箔包中取紅色標(biāo)記混合孔，放在孔架上。7.2.2取同樣數(shù)量的包被了抗體的孔。把暫不使用的孔放回到箔包中，并重新密封，以保護(hù)抗體。7.2.3在使用之前搖動(dòng)試劑瓶，混合每種試劑。7.

7、2.4從蘭色標(biāo)簽瓶內(nèi)吸取100l軛合物加到每個(gè)紅色標(biāo)記的混合孔內(nèi)。棄去吸咀。7.2.5每次使用新吸咀，吸取100l控制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品液按下列順序加到紅色標(biāo)記的混合孔內(nèi) 7.2.6用12道移液器吸入、排出3次使孔內(nèi)溶液徹底混合，吸取100l加到相應(yīng)的包被了抗體的孔內(nèi)，在平的表面上將板前后滑動(dòng)確保充分混合1020秒鐘，不要濺出試劑，混合后于室溫下（1830）放置2分鐘。7.2.7倒掉包被了抗體孔內(nèi)的溶液。在每個(gè)孔內(nèi)加滿蒸餾水或去離子水，再倒掉，如此重復(fù)5次，將板朝下，在吸水材料上拍擊以去除所有的水滴。7.2.8從綠色試劑瓶中倒出所需量的試劑到試劑槽中。7.2.9用12道移液器和新吸咀，吸取100l底物加到每個(gè)孔內(nèi)，在平的表面上將板前后滑動(dòng)確保充分混合1020秒鐘。7.2.10混合后放置1.5分鐘。倒掉試劑槽中剩余的底物并沖洗試劑槽。7.2.11從紅色試劑瓶（終止液）中倒出所需量的試劑到試劑槽中。7.2.12用12通道移液器吸出過量的底物溶液，再吸取100l紅色終止液加到每個(gè)微孔內(nèi)，在平的表面上將板前后滑動(dòng)確保充分混合。7.2.13用干凈的布擦凈板底，將板置于微型孔閱讀器于450nm濾光片下讀數(shù)。由于氣泡會(huì)影響結(jié)果，應(yīng)削除溶液中氣泡。應(yīng)在加入終止液后2