Rab調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究

1、摘 要Toll樣受體家族可以識(shí)別幾乎所有的病原微生物的一些結(jié)構(gòu)組分和代謝產(chǎn)物，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘發(fā)細(xì)胞因子和趨化因子等啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫，構(gòu)成了機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防線，在免疫學(xué)研究中一直是一個(gè)很受關(guān)注的家族。不同TLRs分子有不同的配體，如TLR3主要識(shí)別病毒dsRNA和Poly I:C；TLR4主要識(shí)別LPS等。TLRs的活化是一把雙刃劍。一方面TLRs的活化在啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，另外一方面過(guò)渡活化或者活化異常可能引起急慢性疾病。因此TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)相調(diào)控成為天然免疫研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。曾有實(shí)驗(yàn)表明定位于溶酶體的Rab7b，能夠通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)TLR4受體到溶

2、酶體進(jìn)行降解，從而負(fù)相調(diào)控TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而Rab7和Rab7b在分子水平上，有超過(guò)50的一致性和65的相似性，因此我們推測(cè)Rab7和Rab7b可能有相似的功能。目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立穩(wěn)定表達(dá)Rab7及其突變體的巨噬細(xì)胞系，分析穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的生物學(xué)特性，研究Rab7及其突變體基因過(guò)表達(dá)后對(duì)LPS和Poly I:C刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響。方法：將Rab7及其突變體Rab7(T22N)的真核表達(dá)載體通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，G418選擇性培養(yǎng)基篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)Rab7及Rab7T22N的細(xì)胞系。通過(guò)RT-PCR和Western Blot方法鑒定穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。通過(guò)觀察細(xì)

3、胞形態(tài)及MTT法分析穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的生長(zhǎng)特性。以LPS和Poly I:C刺激穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系不同時(shí)間后檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)量變化。結(jié)果：與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Rab7和Rab7T22N的細(xì)胞中Rab7的mRNA和蛋白水平都顯著增高。Rab7過(guò)表達(dá)后引起細(xì)胞形態(tài)變化并顯著抑制了細(xì)胞增殖，Rab7T22N過(guò)表達(dá)后促進(jìn)細(xì)胞增殖。Rab7過(guò)表達(dá)后，巨噬細(xì)胞在LPS和Poly I:C刺激后分泌的細(xì)胞因子顯著降低，而Rab7T22N過(guò)表達(dá)后其的分泌又恢復(fù)。結(jié)論：成功建立了穩(wěn)定表達(dá)Rab7及其突變體的細(xì)胞系。Rab7過(guò)表達(dá)后抑制了細(xì)胞增殖，負(fù)向調(diào)控了TLR信號(hào)通路。該研究為進(jìn)一步闡明Rab7在TLRs信號(hào)

4、通路中的作用奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵字：TLR3；TLR4；Poly I:C；LPS，Rab7Research of Rab7 negative regulation of TLR3/4 pathwayResearch on the negative regulation of Rab7 on the the TLR3/4 signaling pathway in macrophages AbstractToll-like receptor(TLR) family can identify almost all s some of the structural components and metab

5、olites, induced cytokines and chemokines start the body's natural immunity through the signal transduction pathways,The recoganition of the structural components and metabolites of pathogenic microorganism by Toll-like receptor can iniatiate innate immunity by promoting the production of cytokin

6、es and chemokines, and thus constitue the first line of defence to pathogenic microorganism. constitute the first line of defense of a body to resist pathogenic micro-organismsSince the Toll like receptor iniated , in immunological research has been a popular concern in the familyStudy on the Toll l

7、ike receptor has been a a popular concern in immunological research.However, different TLRs have different ligandligands, such as TLR3 primarily identify viral dsRNA and Poly I:C,TLR4 major recognition LPSand LPS is the ligand for TLR4. .However, the activation of TLR is a double edged sword.on the

8、one hand,On one hand activat TLRs in innate immune responses and adaptive immune responses play an important roleActivation of TLRs play a vital role in the innate and adaptive immune responses, on the other hand, the activation transition and activation anomalism may cause acute and chronic disease

9、s.Overreaction of the signaling of TLRs has reported to be associated with acute and chronic diseases Therefore，negative regulation on the TLR signaling pathway bacome a hot issue .Reports have shown that lysosme-associated Rab7b negatively regulate TLR4 signal transduction by promoting lososomal de

10、gradation of TLR4. Since Rab7 and Rab7b have more than 50% identity and 65% similarity at the molecular level, we ddeduce that Rab7 and Rab7b may have similar functions.Objective: To establish and analyze the biological characteristics of transformed macrophage cell lines stably expressing Rab7and i

11、ts dominant negative mutant Rab7T22N, and study the production of cytokines in transformed macrophage cell lines after stimulation with LPS and Poly I: C. Methods: the eukaryotic expression Vector of Rab7 and Rab7T22N were transfected into RAW264.7 cells by liposome, and screened with G418.The G418-

12、resistant colonies were obtained and amplified. The transformed cell lines were identified by RT-PCR, Real-Time PCR and Western Blot. The characteristics of transformed cell lines were analyzed by observing the cell morphology and MTT methods. The production of cytokines were measured after transfor

13、med cell lines stimulation with LPS and Poly I:C. Results: Compared with the control group, the mRNA and protein expression of Rab7 were significantly improved in cell lines transfected with Rab7 and Rab7T22N. Overexpression of Rab7 changed the cell morphology and inhibited the proliferation of Raw2

14、64.7 cells, while overexpression of Rab7T22N promoted the proliferation of Raw264.7 cells. Overexpression of Rab7 significantly inhibited cytokines production in LPS and poly I:C stimulated macrophages. The production of cytokines were restored in Rab7T22N cell line. Conclusion: Overexpression of Ra

15、b7 inhibits the proliferation of macrophages, and suppresses the production of cytokines in macrophages stimulated with LPS and Poly I: C. The study may lay a foundation for our further study the role of Rab7 in TLRs signaling pathways.Key words: TLR3；TLR4；Poly I:C；LPS；Rab7Directed by: Prof. Wang yu

16、 zhenApplicant for Master degree: Wang Ning Fei （Agricultural Mechanization ?Biochemistry and Molecular Biology)(College of Life Sciences. Inner Mongolia Agricultural University. Hohhot 010018. China)目 錄1引言11.1 Toll家族背景介紹11.1.1 TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)11.1.2 TLR信號(hào)與腫瘤的關(guān)系21.1.3 TLR3、TLR4簡(jiǎn)介及關(guān)聯(lián)2 TLR3、4配體介紹31.2 Rab家族背景介紹

17、41.2.1 Rab5、7、9的簡(jiǎn)介51.3 研究意義61.3.1 Poly I:C/TLR3信號(hào)通路過(guò)渡活化61.3.2 LPS/TLR4信號(hào)通路過(guò)渡活化71.3.3 研究目的7第一部分 Rab7蛋白表達(dá)91 材料91.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑91.2 儀器91.3 試劑配置91.4 引物102 實(shí)驗(yàn)方法102.1 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7的培養(yǎng)102.2細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄102.3 cDNA的制備112.4 PCR反應(yīng)體系112.5 LPS和poly I:C刺激后Rab5a、Rab7、Rab9的mRNA水平表達(dá)時(shí)效關(guān)系研究123 結(jié)果分析123.1 RAW 264.7細(xì)胞的培養(yǎng)及

18、刺激123.2 LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞后Rab5a、Rab7、Rab9的mRNA水平表達(dá)時(shí)-效關(guān)系研究133.3 Poly I:C刺激RAW 264.7細(xì)胞后Rab5a、Rab7、Rab9的mRNA水平表達(dá)時(shí)-效關(guān)系研究143.4 LPS和Poly I:C刺激后RTQ-PCR檢測(cè)Rab7的mRNA水平表達(dá)時(shí)效關(guān)系研究154 討論16第二部分 Rab7調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究181 材料與方法181.1 細(xì)胞株和主要試劑181.2試劑配置18配制聚丙烯酰電泳的試劑181.2.2 轉(zhuǎn)膜的試劑191.3引物191.4 實(shí)驗(yàn)步驟191.4.1 RAW264.7巨噬細(xì)胞的培

19、養(yǎng)191.4.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)201.4.3 突變載體的構(gòu)建201.4.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染201.4.5 蛋白提取201.4.6 BCA檢測(cè)檢測(cè)蛋白濃度211.4.7 SDS-PAGE211.4.8 Western blotting211.4.9 NO、iNOS含量測(cè)定23MTT法測(cè)基因轉(zhuǎn)染對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響232 結(jié)果分析232.1 Rab7突變體穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株的鑒定232.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞RAW264.7生長(zhǎng)形態(tài)242.3Rab7抑制Poly I:C誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TNF-、IL-1的表達(dá)262.4Rab7抑制Poly I:C誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IP-10、IFN-的表達(dá)282.5 Rab7抑

20、制Poly I:C誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NO/iNOs的表達(dá)292.6Rab7抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IP-10、IFN-的表達(dá)312.7 Rab7在LPS介導(dǎo)的TLR4通路中的作用333.討論344展望35致 謝37參 考 文 獻(xiàn)38作 者 簡(jiǎn) 介44縮 略 語(yǔ) 表TLRs(Toll-like receptors) Toll樣受體PPR (Pattern Recognition Receptors) 模式識(shí)別受體IRAKs (IL-1 Receptor-associated Kinases) IL-1R相關(guān)蛋白激酶ERK（extracelluar signal-regulated kinases

21、） 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶JNK(c-Jun-NH2-terminal kinases) c-Jun氨基末端激酶IP-10（IFN-inducible protein 10） 人干擾素誘導(dǎo)蛋白10GARG16（glucocorticoid attenuated response gene 16） 皮質(zhì)激素削弱反應(yīng)基因-16IRG1（IFN-regulated gene 1） INF調(diào)節(jié)基因 3IL-1(interleukin-1) 白細(xì)胞介素1polyI:C (polvriboinsine-polyribocyaidylic acid ) 聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸LPS（lipopolysa

22、eeharide） 脂多糖Rabs（Ras related proteins in brain） Rab蛋白PKC-(protein kinase ） 蛋白激酶CIFN-（interferon） 干擾素IL（intierleukin） 白細(xì)胞介素ORP1L（Oxysterol-binding protein-related protein 1L） 氧固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1LEGFR （epidermal growth factor receptor） 表皮生長(zhǎng)因子iNOS (inducible nitric oxide synthase) 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶1引言1.1 Toll家族背景介紹T

23、oll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類重要的模式識(shí)別受體（Pattern Recognition Receptors, PPR），主要是通過(guò)識(shí)別病原微生物的病原體相關(guān)的分子模式（Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs），廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中，產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，構(gòu)成了機(jī)體抵抗病原微生物入侵的第一道防線。TLRs是型跨膜蛋白，屬于TIR（Toll/interlukin-1(IL-1)receptor）超家族。在結(jié)構(gòu)上一般分為跨膜區(qū)、胞漿

24、區(qū)和胞外區(qū)三部分，共同的結(jié)構(gòu)特征為胞外部分即富含亮氨酸重復(fù)序列（LRRs）。迄今為止已在哺乳類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)TLR家族有13個(gè)成員，其中TLR1-9在人類和鼠類是相同的，TLR10是人類為特有的，而TLR11-13是鼠類特有的1。 TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) Toll樣受體可識(shí)別幾乎所有病原生物的一些結(jié)構(gòu)組份和代謝產(chǎn)物，包括細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體、真菌、螺旋體等2,3。不同TLRs之間的胞外區(qū)同源性較差4，因而不同TLRs分子有不同的配體，且有些Toll樣受體則需通過(guò)協(xié)同作用，識(shí)別不同病原體的特異的PAMPs組合體，而另一些Toll樣受體還可以識(shí)別不止一種PAMP。TLR1主要在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)

25、胞、自然殺傷細(xì)胞(即NK細(xì)胞)上表達(dá)，識(shí)別膜孔蛋白、糖脂、PGN和非典型LPS等5；TLR2在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞大量表達(dá)，可識(shí)別大部分現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)的PAMPs結(jié)構(gòu)，如分枝桿菌和疏密螺旋體的脂蛋白、G+菌的PGN、酵母菌和支原體的某些成分等6,7；TLR3主要表達(dá)在樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上，識(shí)別病毒復(fù)制時(shí)生成的dsRNA和聚肌胞苷酸Poly I:C8；TLR4主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞上，主要識(shí)別脂多糖及具有保守類脂A結(jié)構(gòu)的衍生物9，還能識(shí)別活結(jié)核桿菌的某些成分10；TLR5主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上，識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白11；TLR6主要識(shí)別細(xì)菌的肽聚糖

26、12；TLR7，8識(shí)別抗病毒化合物，許多情況下識(shí)別相同配體ssRNA13；TLR9可以通過(guò)同源二聚體的形式識(shí)別非甲基化CpG DNA 14。另外，TLR2能與TLR1和TLR6形成復(fù)合受體識(shí)別一些微生物成分15。而近年發(fā)現(xiàn)的TLR11主要參與識(shí)別尿路致病性大腸桿菌中某種成分和Profilin樣分子16目前，己發(fā)現(xiàn)有五個(gè)接頭蛋白參與Toll樣受體信號(hào)途徑，MyD88、TRIF、TIRAP、SARM和TRAM。其中MyD88能被所有Toll樣受體招募；TRIF能被TLR3和TLR4招募；TIRAP能被TLR2和TLR4招募；而TRAM只能被TLR4招募。本文主要研究的是MyD88依賴和非依賴兩條胞

27、內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MyD88是一個(gè)連接蛋白，它的作用主要是連接IL-1R與IL-1R相關(guān)蛋白激酶(IRAKs）的。當(dāng)配體與IL-1R結(jié)合之后，將IRAK磷酸化，使其從受體復(fù)合物上脫落，隨后TRAF6促進(jìn)了MAPK激酶ERK(extracellua rsignal-regulated kinases)、JNK(c-Jun-NH2-terminal kinases)和P38磷酸化以及I-B和I-B的降解，使轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控AP-1和NF-B活化和趨化因子(CXC趨化因子MIP-2和KC，以及CC趨化因子MIP-1和JE/MCP-1) ，細(xì)胞因子(TNF-a，IL-6，IL-1和IL-12)的表達(dá)。MyD

28、88非依賴性途徑中的一些成分已經(jīng)被弄清楚了，這些基因包括IFN-、IP-10（IFN-inducible protein 10）、CXC趨化因子家族、GARG16（glucocorticoid attenuated response gene 16）、IRG1（IFN-regulated gene 1）?？傮w來(lái)說(shuō)TLRs信號(hào)通路在抗感染中發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)主要有三個(gè)方面：一是激活NF-B和IRF等轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致大量促炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生，這些促炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子能招募粒細(xì)胞，單核細(xì)胞， NK細(xì)胞等，從而啟動(dòng)并放大炎癥反應(yīng)；二是通過(guò)接頭蛋白參與介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)被感染細(xì)胞的凋亡，

29、下調(diào)感染反應(yīng)性，減輕組織損傷17；三是介導(dǎo)釋放抗炎因子如IL-4、IL-10，IL-12等，負(fù)調(diào)機(jī)體的過(guò)強(qiáng)應(yīng)答，避免自身免疫的發(fā)生18。 TLR信號(hào)與腫瘤的關(guān)系己經(jīng)有研究表明，TLR與多種疾病有著密切關(guān)系，如真菌感染、腫瘤、膿毒癥、皮膚病、動(dòng)脈粥樣硬化、肝臟疾病以及胃腸道疾病有著密切關(guān)系。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，TLRs除了識(shí)別病原體的保守結(jié)構(gòu)，也可以識(shí)別在損傷、應(yīng)激和細(xì)胞非凋亡性死亡等情況下機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的一些內(nèi)源性分子，越來(lái)越多的研究證明熱休克蛋白(heat shock portein，HSP)就是TRL的內(nèi)源性配體。 TLR3、TLR4簡(jiǎn)介及關(guān)聯(lián)Toll家族中的TLR3廣泛表達(dá)在各種組織和細(xì)胞，主要表達(dá)

30、于腦、心臟、肺、胎盤、肌肉、胰腺細(xì)胞中19，而在人胎盤組織表達(dá)最高20。，TLR3可識(shí)別HBV、HCV病毒中的dsRNA，最早研究報(bào)道其主要是通過(guò)MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)誘導(dǎo)IFN-含TIR的結(jié)構(gòu)域(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-，TRIF)傳遞信號(hào)21，合成并釋放一系列的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，引起干擾素等抗病毒蛋白的激活，發(fā)揮其抗病毒作用，抑制受感染細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡22,23。 在TLR3信號(hào)中有一個(gè)種現(xiàn)象：耐受現(xiàn)象。有實(shí)驗(yàn)采用劑量遞增連續(xù)染毒法評(píng)價(jià)Poly I:C的蓄積毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)

31、行劑量遞增法連續(xù)注入Poly I:C后未發(fā)現(xiàn)有明顯的Poly I:C毒性反應(yīng)，沒有小鼠死亡，與對(duì)照組小鼠的體重相比實(shí)驗(yàn)組小鼠體重?zé)o顯著差異。劑量的耐受實(shí)驗(yàn)，表明實(shí)驗(yàn)組小鼠無(wú)死亡現(xiàn)象，而且與對(duì)照組相比差異不顯著，提示實(shí)驗(yàn)組小鼠對(duì)Poly I:C注射液產(chǎn)生了一定程度的耐受性24。人TLR4是最早被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物Toll樣受體25。TLR4分布廣泛，除白細(xì)胞、淋巴組織、樹突狀細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞外，還分布于表皮微血管、小腸上皮細(xì)胞和人齒跟纖維母細(xì)胞、臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞、小鼠脂肪細(xì)胞、人子宮頸平滑肌細(xì)胞、大鼠心肌細(xì)胞及腦組織(脈絡(luò)叢、軟腦膜、正中隆突等)，以及多種腫瘤細(xì)胞膜表面。在損傷和炎癥過(guò)程中TLR4

32、的激活在周圍微環(huán)境內(nèi)發(fā)揮著重要作用，可通過(guò)MyD88依賴和非依賴兩條胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活炎性細(xì)胞，合成并釋放一系列的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，進(jìn)一步誘發(fā)機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)。業(yè)已證明，TLR4在活化后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解46。在TLR4信號(hào)中也有耐受現(xiàn)象：內(nèi)毒素耐受。有實(shí)驗(yàn)表明先用小劑量?jī)?nèi)毒素或其同系物刺激DC或單核巨噬細(xì)胞，隨后再用致死劑量沖擊，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的釋放量大幅度減少甚至不分泌，以保護(hù)機(jī)體不受內(nèi)毒素致死性毒性攻擊，這種現(xiàn)象被稱為“LPS耐受”26。小劑量?jī)?nèi)毒素刺激即可誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受。根據(jù)誘導(dǎo)劑量、間隔時(shí)間、次數(shù)等的不同，分別產(chǎn)生早期耐受和晚期耐受。一般內(nèi)毒素耐受為早期耐受。內(nèi)毒素耐受同細(xì)

33、胞膜TLR4-MD2復(fù)合物的形成下調(diào)密切相關(guān)27。有研究表明因?yàn)門LR3與特異性配體結(jié)合后，可通過(guò)MyD88依賴或非依賴的信號(hào)通路，激活細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。兩種信號(hào)通路最終導(dǎo)致各種促炎癥細(xì)胞因子( IL-1、IL-6、IFN-、和TNF-)和化學(xué)增活素(IP-10)等的合成與釋放，與此同時(shí)會(huì)上調(diào)TLR4，形成正反饋28。 TLR3、4配體介紹聚肌胞(polvriboinsine-polyribocyaidylic acid，Poly I:C) 又名聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸或聚肌胞苷酸，是人造dsRNA，常作為型干擾素誘導(dǎo)劑29，可被TLR3識(shí)別。Poly I:C是一種高效干擾素誘導(dǎo)劑，用于增強(qiáng)

34、巨噬細(xì)胞吞噬作用、激活T細(xì)胞，提高機(jī)體免疫力30，國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)免疫、抗病毒和前列腺癌輔助治療31。有實(shí)驗(yàn)表明Poly I:C可以明顯降低移植腫瘤的生長(zhǎng)速度，降低荷瘤小鼠的死亡率和體內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率32。Poly I:C誘導(dǎo)的TLR3的早期活化及后續(xù)產(chǎn)生的IFN/有助于建立局部的抗病毒狀態(tài)，限制病毒在感染部位復(fù)制。在免疫學(xué)研究中也常用來(lái)Poly I:C模擬RNA病毒感染及病毒致病機(jī)制的相關(guān)研究。內(nèi)毒素(endotoxin)，是革蘭陰性菌及其它一些微生物(立克次體，衣原體等)細(xì)胞壁外膜中的重要組成部分，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(lipopolysaeeharide，LPS)，可被TLR4識(shí)別。它在革

35、蘭陰性菌感染的致病機(jī)理中起著十分重要的作用，它不僅是決定革蘭氏陰性細(xì)菌感染(如感染性休克和膿毒血癥)的主要致病分子，而且與人類其他許多疾病關(guān)系密切，是一種危及人類健康乃至生命的最為重要的病原菌相關(guān)模式分子(PAMP)33。1.2 Rab家族背景介紹Rabs（Ras related proteins in brain）蛋白，屬于Ras超家族，Rab基因編碼的蛋白質(zhì)主要以單體形式存在，一般由200210個(gè)氨基酸組成，分子量多數(shù)為2227kD，由高度保守的GTP/GDP結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和可變的N端與C端組成。Rab家族成員的氨基酸序列的相似性大約在35 %80 %之間，極少數(shù)大于80%。Rab基因普遍存

36、在于果蠅、擬南芥、酵母和人等真核生物中，不同生物類群的Rab亞家族的成員數(shù)量各不相同。如裂殖酵母Rab基因種類較少，僅編碼7個(gè)Rab蛋白，芽殖酵母編碼11個(gè)Rab蛋白，擬南芥中已經(jīng)分別發(fā)現(xiàn)了57種，而人中則編碼了有60多種Rab蛋白。在海洋生物中，僅在日本對(duì)蝦、紫色球海膽等少數(shù)物種中有零星的Rab基因研究。大多數(shù)Rab蛋白沒有組織特異性，而Rab蛋白高度可變的C末端決定著Rab蛋白亞家族成員與細(xì)胞器膜的結(jié)合位置，所以Rab蛋白分布在細(xì)胞內(nèi)的不同膜區(qū)室，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)所有的膜運(yùn)輸過(guò)程34。Rab蛋白能夠在GDP結(jié)合的非活性形式和GTP結(jié)合的活性形式之間轉(zhuǎn)換，調(diào)控著囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的的各個(gè)環(huán)節(jié)，如囊泡的形

37、成、轉(zhuǎn)運(yùn)、錨著以及融合過(guò)程。Rab蛋白家族的不同成員高度局限性地定位在各種囊泡的膜表面，可以用來(lái)對(duì)特定的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)行描述36。例如：Rab1b，Rab2，Rab6，Rab11主要參與了細(xì)胞的調(diào)節(jié)和外排作用，Rab1，Rab2，Rab6與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，Rab11調(diào)節(jié)從高爾基體到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。Rab4，Rab537,38，Rab739，Rab11是細(xì)胞內(nèi)吞和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的主要調(diào)節(jié)蛋白，Rab5則調(diào)節(jié)了籠形蛋白衣被小泡在質(zhì)膜和早期內(nèi)吞體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)，Rab740與晚期內(nèi)吞體的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，Rab3，Rab8b，Rab26，Rab37則與分泌顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)和突觸小泡相關(guān)，而Rab4，

38、Rab11均參與了早期內(nèi)吞體和晚期內(nèi)吞體返回細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，細(xì)胞外的因素便可以通過(guò)改變Rab蛋白與其效應(yīng)分子的活性狀態(tài)來(lái)調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，如Fiory報(bào)道蛋白激酶C（PKC-）通過(guò)對(duì)Rab5和PI3K的影響調(diào)節(jié)胰島素內(nèi)化41。因此理論上Rab蛋白與內(nèi)源抗原遞呈囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，從而成為免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)抗原提呈的環(huán)節(jié)之一。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，Rabs蛋白除了參與調(diào)節(jié)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)外，還廣泛地參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。如Rab5和Rab7可與交叉提呈的MHC I類分子肽復(fù)合物共聚。 還有研究表明，Rab5參與表皮生長(zhǎng)因子（EGFR）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而過(guò)表達(dá)失活突變的Rab5:S34N阻斷了EGFR活化引起的R

39、af-ERK1/2信號(hào)通路以及細(xì)胞的增殖42。Rab7定位于晚期內(nèi)體/溶酶體結(jié)構(gòu)，除了調(diào)控內(nèi)吞過(guò)程的晚期運(yùn)輸外，還參與轉(zhuǎn)運(yùn)受體，如血管緊張素受體1A43、EGFR44、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrKA 45到溶酶體的降解，而受體所在的位置和轉(zhuǎn)歸決定著信號(hào)輸出的結(jié)果。 Rab5、7、9的簡(jiǎn)介Rab5a蛋白主要存在于質(zhì)膜、網(wǎng)格蛋白覆蓋的囊泡和早期內(nèi)體上，它主要負(fù)責(zé)調(diào)控胞吞過(guò)程中早期內(nèi)體(early endosome)與胞吞泡的融合，是早期胞吞途徑中一個(gè)重要的限速成分。隨著對(duì)Rab5a結(jié)構(gòu)與功能的深入研究，越來(lái)越多的證據(jù)表明Rab5a不但參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)分選，而且還與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架重建和受體下

40、調(diào)等功能密切相關(guān)47。Rab7在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平存在差異，可能與細(xì)胞的內(nèi)吞活性有關(guān)。Rab7在早期內(nèi)體到晚期內(nèi)體以及晚期內(nèi)體到溶酶體的膜泡運(yùn)輸中起重要作用。但Rab7在這兩個(gè)途徑中的效應(yīng)分子不同，從早期胞內(nèi)體到晚期胞內(nèi)體的膜泡運(yùn)輸中需要Rabring7和RILP（Rab7-interacting lysosomal protein），Rab7募集相關(guān)的溶酶體蛋白R(shí)ILP和氧固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1L (Oxysterol-binding protein-related protein 1L，ORP1L)，然后共同募集和活化馬達(dá)分子動(dòng)力蛋白，從而驅(qū)使晚期內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)到微管負(fù)末端，最后調(diào)節(jié)晚期內(nèi)體向

41、液泡/溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)。從晚期內(nèi)體到溶酶體的膜泡運(yùn)輸過(guò)程中Rab7的效應(yīng)分子是SAND-148。甲狀腺激素的產(chǎn)生和膽固醇水平的調(diào)節(jié)也與Rab7基因有關(guān)。Rab9也是Rab蛋白家族成員之一，屬于小GTP酶。Rab9主要定位于晚期內(nèi)體，與甘露糖6-磷酸受體（MPR)從晚期內(nèi)體到反式高爾基網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)聯(lián)。Rab9 GTPase和其效應(yīng)蛋白TIP47粘合可增強(qiáng)TIP47和MPR胞漿區(qū)域的相互作用。1.3 研究意義在第一部分的介紹可知TLRs可誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答維護(hù)機(jī)體，但TLRs的活化是一把雙刃劍。TLRs誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答在抵抗和清除微生物感染、維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了重要作用，甚至可以促進(jìn)腫瘤

42、細(xì)胞上調(diào)表達(dá)以產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而，TLRs的過(guò)渡活化或者活化異?？赡芤鸺毙院吐约膊?，而且還可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞使其逃避免疫監(jiān)視。近期研究還證實(shí)TLRs在機(jī)體損傷及免疫逃避、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸道疾病、動(dòng)脈粥樣硬化形成、移植排斥反應(yīng)等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。 Poly I:C/TLR3信號(hào)通路過(guò)渡活化Poly I:C既可以誘生干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而殺滅腫瘤細(xì)胞，還可能通過(guò)提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能來(lái)增強(qiáng)免疫效應(yīng)。如Poly I:C可能通過(guò)對(duì)TLR3的早期活化，來(lái)抑制hMPV在小鼠肺內(nèi)的復(fù)制，從而減輕肺部炎癥。但是在利用Poly I:C誘生干擾素時(shí)由于種類和個(gè)體差異會(huì)導(dǎo)致

43、毒性的產(chǎn)生，如對(duì)小鼠ICR-JCL小鼠進(jìn)行尾靜脈和腹腔注射Poly I:C注射液(1mg/mL)。小鼠會(huì)急性死亡，其過(guò)程表現(xiàn)為：先萎靡遲鈍和畏冷，之后便開始體溫下降、呼吸困難，其鼻粘膜、口腔和四肢發(fā)紺，并有腹瀉的癥狀。靜脈注射死亡多在3-6h，腹腔注射一般需要6-8h50。而在人醫(yī)臨床較大劑量(大于1mg/kg)應(yīng)用時(shí)，病人通常會(huì)表現(xiàn)出流感癥狀51，其中發(fā)熱是最為典型的癥狀，同時(shí)也可能誘導(dǎo)產(chǎn)生一些自身免疫疾病52。另外有實(shí)驗(yàn)表明：Poly I:C在引起小鼠產(chǎn)生自身抗體的同時(shí)也可能導(dǎo)致肝組織損傷，有引發(fā)自身免疫性肝病的趨勢(shì)。自身免疫性肝病主要包括:自身免疫性肝炎(autoimmune hepat

44、itis，AIH)、原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)和原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)。它們血清中均出現(xiàn)不同程度的自身的抗體升高和肝臟炎性浸潤(rùn)，但自身抗體的類型和肝臟損傷的部位及程度均有所不同53。除此之外，TLR3還可以通過(guò)引起組織損傷促進(jìn)病毒擴(kuò)散。Martha HatchenS54等研究發(fā)現(xiàn)，給圍產(chǎn)期內(nèi)的TLR3缺陷鼠和野生型小鼠分別接種牛痘病毒，與野生型小鼠相比，TLR3缺陷鼠中病毒復(fù)制量明顯減少，病毒擴(kuò)散速度明顯減慢，存活率也增高，肺炎患病率明顯下降，此實(shí)驗(yàn)提示TLR3在牛痘感染

45、中可能引起了不良的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致患者發(fā)病率和死亡率上升。Diamond和Klein等有報(bào)道，TLR3在血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上有高表達(dá)，west Nile病毒感染后，dsRNA通過(guò)與TLR3作用導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡，破壞了血腦屏障，從而促使病毒加速進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致宿主的病情加重，而與野生型小鼠相比，TLR3缺陷鼠外周血中病毒復(fù)制較快，炎癥反應(yīng)較強(qiáng)，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中病毒顆粒顯著減少，病理改變明顯減弱。通過(guò)Hepatotropic PuntaToro Virus感染TLR3缺陷型鼠和野生型鼠的研究發(fā)現(xiàn)，TLR3缺陷型鼠的肝炎發(fā)病率明顯下降55。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TLR3通過(guò)引起組織損傷促進(jìn)了病毒的擴(kuò)散

46、。TLR3介導(dǎo)的促病毒擴(kuò)散可能與TLR3誘導(dǎo)的組織損傷有關(guān)。除正常細(xì)胞外，TLR3也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡56。 以上例子表明TLR3對(duì)于病毒感染的作用除了可以通過(guò)天然性和獲得性免疫抑制病毒的復(fù)制、促進(jìn)病毒的清除；還可以介導(dǎo)的組織細(xì)胞的損傷，從而介導(dǎo)病毒的擴(kuò)散。 LPS/TLR4信號(hào)通路過(guò)渡活化LPS可通過(guò)TLR4介導(dǎo)細(xì)胞，特別是單核巨噬細(xì)胞，合成并釋放各種細(xì)胞因子，再通過(guò)旁分泌或體循環(huán)作用于其他組織細(xì)胞，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，嚴(yán)重者導(dǎo)致多器官功能衰竭、休克和死亡。然而，近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，除了髓樣細(xì)胞發(fā)揮作用外，內(nèi)皮細(xì)胞在LPS引起的內(nèi)毒素休克和多器官功能衰竭等病理過(guò)程中也

47、起著重要的作用57。雖然對(duì)LPS的確切作用現(xiàn)在仍有爭(zhēng)論，但它在啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)，導(dǎo)致中毒性休克中的重要性己得到了普遍的認(rèn)識(shí)。 研究目的因此，如何負(fù)相調(diào)控TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為天然免疫研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。鑒于負(fù)相調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，發(fā)現(xiàn)新的抑制性分子不僅有助于加深理解TLR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，而且能為藥物治療炎癥性疾病提供新的靶點(diǎn)。有研究結(jié)果表明，Rab7的同源分子Rab7定位于溶酶體，能夠?qū)LR4受體轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解，從而負(fù)相調(diào)控TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)16。鑒于Rab7和Rab7b在分子水平上，有超過(guò)50的一致性和65的相似性，因此我們推測(cè)Rab7和Rab7b可能有相似的功能。而從Rab蛋白研究發(fā)展

48、角度上說(shuō)，目前約有40個(gè)Rab蛋白被發(fā)現(xiàn)，它們定位在胞內(nèi)各個(gè)細(xì)胞器，調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的各個(gè)環(huán)節(jié)。但通過(guò)人類基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)大約有60多個(gè)Rab蛋白的EST，因此對(duì)Rab蛋白的研究任重而道遠(yuǎn)。同時(shí)對(duì)Rab蛋白的深入研究有助于細(xì)胞膜內(nèi)外，胞漿中各個(gè)細(xì)胞器之間及胞漿胞核之間蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制體系的進(jìn)一步完善，并為臨床上由于蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常而引起的疾病提供新的思路和方法。本課題擬采用小鼠單核/巨噬細(xì)胞株RAW264.7作為細(xì)胞模型，研究Rab7在TLR3配體poly I:C和TLR4配體LPS刺激下的表達(dá)模式；采用多種方法和手段研究Rab7對(duì)TLR3、TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討其發(fā)揮作用的機(jī)制。

49、本項(xiàng)目的完成有助于深入理解天然免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制，為尋找感染性疾病治療的靶標(biāo)提供科學(xué)的依據(jù)。第一部分 Rab7蛋白表達(dá)大多數(shù)Rab蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中組成性表達(dá)。但是一些Rab蛋白的表達(dá)水平會(huì)受到炎性刺激或疾病的影響。如cAMP能促進(jìn)Rab5a和Rab7的表達(dá)；同樣在巨噬細(xì)胞中IFN-能增強(qiáng)Rab5a的表達(dá)水平；病原蟲T.cruzi感染心肌細(xì)胞后，Rab7和Rab11表達(dá)下調(diào)58?？梢奟ab蛋白參與了病毒或外源物參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。LPS和poly I:C是否也對(duì)Rab5a、Rab7和Rab9的表達(dá)有影響，至今沒有研究報(bào)道，但之前有研究表明，定位于溶酶體Rab7b的表達(dá)能夠受LPS和Poly I:

50、C刺激影響，并且將TLR4受體轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解，從而負(fù)相調(diào)控TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)59 。Rab7是Rab7b的同源分子，鑒于Rab7和Rab7b在分子水平上，有超過(guò)50的一致性和65的相似性，因此我們推測(cè)Rab7和Rab7b可能有相似的功能。據(jù)報(bào)道Rab5和Rab7與交叉遞呈囊泡的MHC-I類分子復(fù)合物共聚。而Rab9參與甘露糖6-磷酸受體從晚期內(nèi)體到反式高爾基網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而考慮是否Rab5和Rab9可能也參與了LPS/TLR4和Poly I:C/TLR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。我們希望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究一下在Poly I:C和LPS誘導(dǎo)TLR3/4信號(hào)通路時(shí)是否會(huì)影響Rab5a、Rab7和Rab9的表

51、達(dá)。1 材料1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7、胎牛血清（購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)），DMEM培養(yǎng)基、LPS、poly I:C（均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品），RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶，（均為寶生物公司產(chǎn)品）real time mix（康為世紀(jì)）。1.2 儀器CO2培養(yǎng)箱（310576-2601，Thermo），酶標(biāo)儀（MULTISKAN MK3，Thermo），超凈臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）， 梯度PCR儀(BIO-RAD，美國(guó)) ，低溫離心機(jī)（CT15RT，Versatile Refrigerated Centrifuge），電泳儀全自動(dòng)凝

52、膠成像系統(tǒng)，ABI 7300 (Applied Biosystems，USA)。1.3 試劑配置(1)PBS NaCl 8.0gKCL 0.2gNaHPO4 1.15gKH2PO4 0.2gPH值為7.8，并定容到1L。(2)凍存液：20% 的血清；70% DMEM；10% DMSO(3)TAE Tris酸 24.2g冰乙酸 5.71mlEDTAH2O 3.72g并定容到1L。1.4 引物表1 引物序列名稱序列長(zhǎng)度Rab5a-senceRab5a-anitsenceRab7-senceRab7-antisenceRab9-senceRab9-antisence5-GGA GCA ACA AGA

53、 CCC AAC G- 35-AGG ACT TGC TGG CCT TGG A- 35-CAC TTT CAA AAC CCT CG- 35-TTC TTG GCA CTG GTC TCG-35-CTT GGA GAT GGT GGA GTT G- 35-AGT CGC CGT TGT CCT TGC - 3359bp324bp405bp2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7的培養(yǎng)(1)將在液氮中保存的RAW 264.7細(xì)胞株在37水浴鍋中解凍；(2)1500rpm離心5min后，棄上清；(3)混懸沉淀細(xì)胞，后接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；(4)置37，5% CO2

54、培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1-2d換液或傳代一次。2.2細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄按Trizol試劑說(shuō)明進(jìn)行。(1)貼壁細(xì)胞用PBS洗2次，按1×107細(xì)胞加入1 ml細(xì)胞總RNA抽提試劑Trizol，充分勻漿，室溫放置5min；(2) 加入0.2 ml氯仿上下顛倒充分混勻，室溫靜置5min；(3)12000g，4°C離心15分鐘；(4)從離心機(jī)中取出離心管，此時(shí)勻漿液分三層，取無(wú)色上清層；(5)加入等體積的異丙醇，室溫靜置10分鐘；(6)4°C、12.000 g離心15分鐘；(7)棄上清，沉淀以75 %乙醇洗滌；(8)4°C、7.500 g離心5分鐘后，空氣干燥；(

55、9)溶解于40 ml DEPC處理的水溶液，進(jìn)行濃度和純度測(cè)定后保存于80°C。 2.3 cDNA的制備表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑體積5×PrimeScript TM BufferPrimeScript TM Buffer RT Enzyme MixOligodT PrimerRandon 6 mersTotal RNA2µl0.5µl0.5µl0.5µl1µg加RNase Free dH2O到10µl體系，42°C ，15min；85°C 。2.4 PCR反應(yīng)體系 Rab5a的反應(yīng)參數(shù)： 98°C 10min94°C 30s 47°C 30s 30cycles72°C 30s 72°C 10minRab7的反應(yīng)參數(shù)： 98°C 10min94