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3、庫的構(gòu)建-第二軍醫(yī)大學(xué)2001年博士論文人紅細(xì)胞嘧啶5'-核苷酸酶（EC3.1.3.5.P5'N）缺陷可導(dǎo)致遺傳性非球形細(xì)胞溶血性貧血。其發(fā)病率占所有遺傳性紅細(xì)胞酶病中第三位。至今己報(bào)道35個(gè)家系，約70多例。目前已發(fā)現(xiàn) P5'N有兩種同工酶：和 P5'N-，僅P5'N-I缺乏可引起溶血性貧血，而P5'N-的活力正常，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。為進(jìn)一步研究其生化特性，獲得P5'N的cDNA序列，進(jìn)而得出該酶的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，以進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)制。我們在純化P5'N-的基礎(chǔ)上，對該酶蛋白進(jìn)行了分析鑒定和微量測序，對一例遺傳性P5&#

4、39;N-I缺陷癥家系進(jìn)行追蹤調(diào)查，并構(gòu)建了相應(yīng) cDNA文庫。 方法： 一、建特異性親和層析柱，純化人紅細(xì)胞P5'N-。 二、對純化的P5'N-分析鑒定、微量測序及氨基酸組成分析 1、對純化的 P5'N-IESI質(zhì)譜分析。 2、通過將純化的P5'N-I液直接送檢；轉(zhuǎn)至PVDF膜的 P5'N-液；經(jīng) 胰蛋白酶水解，HPLC收集水解片段進(jìn)行微量測序。 3、將所測序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找同源性片段。 4、將純化的 P5'N-液經(jīng)酸水解后，進(jìn)行氨基酸組成分析。 三、對一例遺傳性 P5'N-I缺陷癥家系進(jìn)行酶活力、酶蛋白定量及外周血紅 細(xì)胞形

5、態(tài)調(diào)查，并將其白細(xì)胞凍存，保存基因資源。 四、用經(jīng)G-CSF、GM-CSF動(dòng)員后分離的正常人外周血CD34細(xì)胞作為mRNA來 源，構(gòu)建PCR介導(dǎo)的cDNA文庫。 結(jié)果： 一、交聯(lián)率40，達(dá)到了親和層析純化蛋白所要求的標(biāo)準(zhǔn)。純化蛋白SDS-PAGE 示單一條帶。 二、對純化的 P5'N-I分析鑒定、微量測序及氨基酸組成分析 1、對P5'N-I的分子量質(zhì)譜分析為26952.5，同時(shí)發(fā)現(xiàn)存在另外兩種蛋 白片段，分子量分別為55476及110938。兩者分別為酶分子量的二倍 及四倍。 2、對該酶蛋白微量測序表明，其蛋白質(zhì)分子中含有Ile（異亮)-Glu（谷） 且第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院血液

6、科 博士畢業(yè)論文一中文擱要 一Gly（甘）一Pro（脯）一Thr（蘇）一lie（異亮）一Arg（精）一GIN（谷 恍）一lie（異亮）一Gin（谷）序歹。 3、經(jīng)blast進(jìn)行相似性搜索，未發(fā)現(xiàn)同源性片段。 4、氨基酸組成分析示：該酶蛋白至少由18種氨基酸，約243個(gè)氨基酸 殘基組成。 三、家系調(diào)查結(jié)果表明：發(fā)現(xiàn)一例雜合子，其酶活力下降至正常值50，酶蛋 白定量亦下降至正常值50以下。 四、cDNA文庫的容量為28x10pfu八g，插入片段全長性占775兒 平均長 度為1235hP。 結(jié)論： l、正常人紅細(xì)胞 PSNI生理狀態(tài)下，可能為一種變構(gòu)酶，以同源四聚體 的方式發(fā)揮作用。 2、所狽部分氨基酸序列（lieGinGlyProThrlieArsGIN11eGin），在 數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)同源性片段，該序列可作為篩選目的基因的探針。所測氨 基酸組成為確定其蛋白一級結(jié)構(gòu)提供了重要依據(jù)。 3、除測定PSNI活力外，測定陀NI酶蛋白含量可