熒光標(biāo)記蛋白的發(fā)展ppt課件

1、LOGO熒光標(biāo)志蛋白的開展 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 工商管理0901 李佳佳熒光標(biāo)志蛋白技術(shù)實踐上是也是一種標(biāo)志技術(shù)。就好像最早用P標(biāo)志脫氧核糖核酸用S標(biāo)志蛋白質(zhì)是一樣。左圖所示為驗證DNA和蛋白質(zhì)誰是遺傳物質(zhì)的實驗熒光標(biāo)志蛋白在生物研討反面的作用：熒光標(biāo)志蛋白的基因熒光標(biāo)志蛋白在生物研討反面的作用：熒光標(biāo)志蛋白的基因可作為報告基因，提供細胞內(nèi)物質(zhì)的跟蹤定位可作為報告基因，提供細胞內(nèi)物質(zhì)的跟蹤定位 如下圖為肽鏈的構(gòu)成過程肽鏈經(jīng)過彎曲、折疊、多條肽鏈的重疊等構(gòu)成蛋白質(zhì)。所以，如假設(shè)一開場便把熒光標(biāo)志蛋白的基因插入到某一特定基因內(nèi)，那么新的基因會合成熒光交融蛋白如左圖所示，當(dāng)體內(nèi)物質(zhì)交融了熒光蛋白后會發(fā)出熒

2、光，用顯微鏡、熒光計、熒光激活細胞分選儀等就可以看見，假設(shè)在接近體表處且光源劇烈那么肉眼可視。例如，要研討細胞內(nèi)某蛋白質(zhì)的游走形狀，那么用熒光蛋白標(biāo)志后，其所處位置明晰可見。 最早為水母體中提取的GFP在適當(dāng)刺激下會改動構(gòu)造從而發(fā)出或改動熒光的第二類熒光蛋白FHP及其典例GPAC 最新的PRIME技術(shù)技術(shù)變革技術(shù)變革GFP1，GFP的發(fā)現(xiàn)GFP是從一種生活在北太平洋冰冷水域的水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。這種水母體內(nèi)含有一種生物發(fā)光蛋白質(zhì)aequorin，它本身發(fā)藍光。GFP能把這種光轉(zhuǎn)變成綠色，也就是當(dāng)水母容光煥發(fā)的時候我們實踐看到的顏色。遭到Ca2+或紫外線激活時, 水母中的發(fā)光蛋白Aequorin 被

3、激活, 產(chǎn)生藍光, GFP 可以吸收藍光( 395nm 處有最大光吸收) , 發(fā)射綠色( 或黃綠色) 熒光 2，GFP發(fā)光原理GFP控制光的部位是其本身的一部分，僅由氨基酸構(gòu)建而成，該部位含有一段三個氨基酸組成的特殊序列：絲氨酸酪氨酸甘氨酸有時絲氨酸會被類似的蘇氨酸取代。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時，這段短片段就被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，然后，發(fā)生一系列化學(xué)反響：甘氨酸與絲氨酸之間構(gòu)成化學(xué)鍵，生成一個新的閉合環(huán)，隨后這個環(huán)會自動脫水。最終，經(jīng)過大約一個小時的反響，周圍環(huán)境中的的氧氣攻擊酪氨酸的一個化學(xué)鍵，構(gòu)成一個新的雙鍵并合成熒光發(fā)色團。蛋白質(zhì)鏈構(gòu)成一個圓柱形罐頭藍色，子鏈的一部分直接從中間穿過綠色，發(fā)色團剛好

4、在罐頭盒的中間，它被維護起來以免受周圍環(huán)境的影響。這種維護對于發(fā)射熒光是必需的。 3，與其他報告基因不同的性質(zhì)從生化角度來講, 一切知的熒光素酶都是氧化酶, 它利用分子氧來氧化底物, 使產(chǎn)物分子處于一種激發(fā)態(tài)而發(fā)光。這種酶/底物的相互作用是生物發(fā)光的普遍方式。而GFP 是第一個例外, 它的27kDa 的單體由238 個氨基酸構(gòu)成, 本身就是一個生物發(fā)光系統(tǒng)。其熒光機制是本身含有的, 綠色熒光的發(fā)射僅需分子氧的存在, 而無需其他外源輔因子GFP 的表達無種屬特異性。不論細胞的種類和位置如何, 都可以自主表達; GFP 還能抑制穿透、毒素、光漂白等不利要素1。GFP 的熒光可以耐受福爾馬林的固定,

5、 因此可以制生長期保管的標(biāo)本; 對細胞內(nèi)GFP 的檢測非常簡單, 用顯微鏡、熒光計、熒光激活細胞分選儀等就可實現(xiàn)4，GFP目前存在的缺乏( 1) 檢測靈敏度還有待提高, 而且其熒光信號強度方面的非線性性質(zhì)使得定量非常困難。( 2) 新生GFP 折疊和加工成為具有熒光活性方式的過程非常緩慢, 使得某些快速過程如轉(zhuǎn)錄的激活過程還難以用該方法進展研討。( 3) 紫外激發(fā)對某些GFP 有光漂白和光破壞作用, 導(dǎo)致熒光信號快速喪失。( 4) 多數(shù)生物具有微弱的自發(fā)熒光景象, 并有著類似的激發(fā)和發(fā)射波長, 這些熒光背景會影響某些GFP 的檢測。 FHPfluorescent highlighter pro

6、teins光激活蛋白即第二類熒光光激活蛋白即第二類熒光蛋白蛋白及及GPAC Green photoactivatable Cherry光激光激活綠櫻桃活綠櫻桃 1，第二類熒光蛋白，F(xiàn)HP特點這些熒光蛋白在適當(dāng)?shù)拇碳は聲啔v構(gòu)造的改動，從而翻開熒光這個開關(guān)，或者熒光發(fā)射波長改動。與第一代熒光蛋白相比，它們的優(yōu)勢在于能脈沖標(biāo)志細胞或分子亞群，從而實現(xiàn)復(fù)雜的動力學(xué)時空分析典例：PAGFP，mRFP1，KFP1，Dronpa等缺陷：其中一些蛋白光轉(zhuǎn)換效率不高，亮度較低，會迅速淬滅，或者需求多聚化。此外，光轉(zhuǎn)換通常伴隨著第一種顏色的喪失，這樣不得不借助計算機方法來查看整個群體。2,GPAC構(gòu)成：這是一個

7、交融蛋白，它交融了紅色熒光蛋白RFP單體Cherry和GFP的光激活變異體。這種交融蛋白可以在表達標(biāo)志物的細胞中繼續(xù)發(fā)出紅色熒光，而綠色熒光只需在405-nm光激發(fā)下才會發(fā)出。特點：表達GPAC的細胞在光激活前后都表現(xiàn)出強的紅色信號，而綠色熒光只繼續(xù)數(shù)小時。將某一特定蛋白放置在GPAC的N端或C端，均不影響其活性，也不會顯著影響胞內(nèi)蛋白的定位或功能。即使交融伴侶需求大量的翻譯后加工和修飾，GPAC仍可容忍。缺乏：熒光標(biāo)簽相對較大，超越了50 kDa，這樣，與GPAC交融的蛋白在用于功能研討前就必需進展仔細的驗證其出色性表達在：在時空動力學(xué)監(jiān)測中突出了光轉(zhuǎn)換的部分。PRIME技術(shù)技術(shù)開發(fā)此技術(shù)的

8、緣由：無論是GPAC還是GFP，他們都有一個缺陷，蛋白過大。一旦熒光探針過大，它們就有能夠干擾蛋白的正常功能，或妨礙它們到達目的地。如：238個氨基酸的GFP干擾了一些蛋白的功能，比如肌動蛋白actin。此蛋白參與了細胞分裂、運動及通訊。然而研討人員發(fā)現(xiàn)，與GFP的交融對肌動蛋白的功能和運輸有著不利影響。概述：概述：PRIME技術(shù)運用一種比技術(shù)運用一種比GFP小小得多的藍色熒光探針。與得多的藍色熒光探針。與GFP不同的是，不同的是，新探針一開場并不與目的蛋白相連。它新探針一開場并不與目的蛋白相連。它是在后來經(jīng)過一種全新的酶而附在蛋白是在后來經(jīng)過一種全新的酶而附在蛋白上。這種全新的酶被稱為熒光基

9、團銜接上。這種全新的酶被稱為熒光基團銜接酶。酶。原原理：理：原理：在導(dǎo)入目原理：在導(dǎo)入目的基因的同時也的基因的同時也將編碼這種酶的將編碼這種酶的基因?qū)爰毎；驅(qū)爰毎?。還在目的基因上還在目的基因上加上了一個短的加上了一個短的標(biāo)簽標(biāo)簽13個氨基個氨基酸，此標(biāo)簽讓酸，此標(biāo)簽讓銜接酶識別蛋白銜接酶識別蛋白隨后，目的蛋白質(zhì)與熒光基團蛋白質(zhì)同時產(chǎn)生當(dāng)7-香豆素這種藍色熒光探針進入細胞后，銜接酶將它與目的蛋白上的短標(biāo)簽相連。這便使交融熒光蛋青絲出可見熒光 優(yōu)點：優(yōu)點：運用這種方法后，標(biāo)有熒光探針的肌動運用這種方法后，標(biāo)有熒光探針的肌動蛋白能在細胞中自在游走，并穿過細胞核。蛋白能在細胞中自在游走，并穿過細胞核。此方法能運用于細