FACSDiva操作說(shuō)明

1、FACSDiva操作說(shuō)明書(shū)首先熟悉一下Diva的操作界面1 通過(guò)點(diǎn)擊菜單欄的相應(yīng)的按鈕，可以隱藏或展開(kāi)相應(yīng)的模塊2 Browser通過(guò)Browser，可以對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行管理，Browser列出了文件夾、實(shí)驗(yàn)、及實(shí)驗(yàn)所包含的樣本和管子。 3 Acquisition control 對(duì)獲取和記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行操作4 Instrument 儀器設(shè)置儀器框顯示了儀器連接狀態(tài)，當(dāng)打開(kāi)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，試管指向定位于一個(gè)試管時(shí)，這個(gè)框顯示的是當(dāng)前試管的儀器設(shè)置。5 瀏覽框 瀏覽框顯示了 worksheet或者 Browser中選中的部件的屬性，可進(jìn)行修改。6 worksheetWorksheet框，可進(jìn)行畫(huà)圖、設(shè)門(mén)、設(shè)邏

2、輯關(guān)系，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)等。7獲取狀態(tài)顯示了獲取或記錄數(shù)據(jù)時(shí)的狀態(tài)。在基本熟悉Diva的界面后，下面就進(jìn)行一個(gè)實(shí)驗(yàn)。在Diva軟件上進(jìn)行操作，必須先新建一個(gè)實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)必須建立在文件夾中）。下面描述的是如何使用這些命令：Creating a Folder and an Experiment這部分描述了如何創(chuàng)建一個(gè)Practice文件夾和包含有基礎(chǔ)分析的實(shí)驗(yàn)。1、在瀏覽框的菜單欄中單擊2、重命名為Practice，如下圖3、選擇Practice文件夾，點(diǎn)擊瀏覽框菜單欄的在文件夾下就創(chuàng)建了一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)包含了默認(rèn)的儀器設(shè)置和一個(gè)空白的global worksheet。4、點(diǎn)及增加Specimen快捷

3、鍵，可加一個(gè)樣本和試管。5、瀏覽框中點(diǎn)擊左邊的樣本指向，指向tube-001。樣本指向變成綠色，說(shuō)明當(dāng)前Expriment和Acquizition control中顯示該tube的屬性。6、在Browser中選擇每一項(xiàng)，看看Inspector框的變化。當(dāng)tube-001被選擇時(shí)，在Inspector中可以看到有四個(gè)標(biāo)簽，分別點(diǎn)擊看看變化。在這版軟件中，一些儀器設(shè)置不能在Inspector中修改。當(dāng)與流式細(xì)胞儀相連接時(shí)，可以在Instrument框中改變電壓、域值和補(bǔ)償。7、選擇ExprimentExpriment Layout，對(duì)每個(gè)參數(shù)進(jìn)行定義，如下圖。當(dāng)你的實(shí)驗(yàn)包含有很多試管時(shí)，你可以用E

4、xpriment Layout 來(lái)一次標(biāo)記所有試管。8、在Expriment Layout 對(duì)話框中，點(diǎn)擊Acquisition標(biāo)簽，選擇Tube-001，改變計(jì)數(shù)粒子為10000，點(diǎn)擊OK。當(dāng)你在瀏覽框中選擇Tube001時(shí)，在Inspector中的Labels和Acqui中的選項(xiàng)也隨著改變。9、在Global worksheet中創(chuàng)建一個(gè)FSC vs SSC點(diǎn)圖在worksheet菜單欄中點(diǎn)擊，再在worksheet中點(diǎn)擊一下，就創(chuàng)建了一個(gè)默認(rèn)大小點(diǎn)圖。10、在FSC vs SSC點(diǎn)圖中邊上創(chuàng)建一個(gè)PE直方圖在worksheet菜單欄中點(diǎn)擊直方圖工具，再點(diǎn)擊worksheet，一個(gè)默認(rèn)大小

5、的直方圖就建立好了。點(diǎn)擊X軸標(biāo)簽，在下拉菜單中選擇PE-A，可改變圖的參數(shù)。注意參數(shù)的名字是你先前設(shè)定的參數(shù)名。11在FSC vs SSC點(diǎn)圖下面創(chuàng)建一個(gè)FITC vs PerCP-Cy5.5的點(diǎn)圖按住Ctrl鍵，點(diǎn)擊FSC vs SSC圖的邊緣，往下拖。當(dāng)你拖的時(shí)候，就創(chuàng)建了一個(gè)復(fù)制的點(diǎn)圖。把點(diǎn)圖放在合適的位置，松開(kāi)鼠標(biāo)，這個(gè)方法可以復(fù)制任何的點(diǎn)圖。點(diǎn)擊坐標(biāo)軸，選擇合適的參數(shù)。12創(chuàng)建一個(gè)Population HierarchyPopulation Hierarchy是用來(lái)列出定義的亞群。右擊任何點(diǎn)圖，選擇Show Population Hierarchy，把結(jié)果圖拖到FITC vs Per

6、CP-Cy5.5點(diǎn)圖的右側(cè)。Worksheet應(yīng)該看起來(lái)類似于下圖：Exporting an Experiment as a Template現(xiàn)在已經(jīng)創(chuàng)建好一個(gè)實(shí)驗(yàn)了，可以導(dǎo)出成為一個(gè)模板。實(shí)驗(yàn)?zāi)０灏藰颖?、試管、關(guān)鍵詞、儀器設(shè)置、標(biāo)簽、worksheet上的圖以及worksheets（包括所有設(shè)置，如分頁(yè)），但不包含有數(shù)據(jù)。 一個(gè)實(shí)驗(yàn)可以保存為一個(gè)模板，為了簡(jiǎn)化瀏覽框，模板不通過(guò)瀏覽框選擇。1、在瀏覽框中選擇Expriment-001，再選擇FileExportExpriment Template。確定選擇的是Expriment Template 命令，而不是Expriment命令。Exp

7、ort Experiment Template Wizard出現(xiàn)，對(duì)話框上的黑體字告訴你每個(gè)框的作用2在模板類型中輸入Practice，模板名字中輸入Simple Analysis。模板類型用來(lái)對(duì)類似的模板進(jìn)行分組，以便于查找。當(dāng)你在創(chuàng)建一個(gè)模板時(shí)，至少要輸入類型和名字，后面的選項(xiàng)是可選項(xiàng)。3點(diǎn)擊Next，可查看后面的選項(xiàng)，點(diǎn)擊Finish。Creating an Experiment from a Template現(xiàn)在可以用原來(lái)保存的模板來(lái)創(chuàng)建一個(gè)實(shí)驗(yàn)。記住當(dāng)你想在一個(gè)文件夾中創(chuàng)建一個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先要選擇文件夾。1、選擇Practice文件夾，選擇Experiment New Experime

8、nt。當(dāng)你想用原來(lái)保存的Exprement模板時(shí)，使用菜單欄而不是快捷鍵，你也可以按Ctrl-E。Experiment Templates對(duì)話框出現(xiàn)2、在對(duì)話框中，點(diǎn)擊Practice標(biāo)簽，選擇Simple Analysis template，點(diǎn)擊鍵。Experiment Layout 對(duì)話框出現(xiàn)，顯示試管標(biāo)記、關(guān)鍵詞、模板的設(shè)置等。3點(diǎn)擊Experiment Layout對(duì)話框中的各種標(biāo)簽，查看設(shè)置，然后點(diǎn)擊Cancle。這些設(shè)置是你建立模板時(shí)設(shè)定的，注意：這些數(shù)據(jù)是只讀的，不能修改。4點(diǎn)擊OK建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)注意原先的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)關(guān)閉，一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)Simple Analysis在瀏覽框中。當(dāng)你

9、在做實(shí)驗(yàn)時(shí)，一次只能打開(kāi)一個(gè)實(shí)驗(yàn)。注意global worksheet中包含有點(diǎn)圖和Population Hierarchy，在點(diǎn)圖中沒(méi)有數(shù)據(jù)。Importing an Experiment接下來(lái)，你將在Practice文件夾中導(dǎo)入一個(gè)實(shí)驗(yàn)。導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)與導(dǎo)入模板的不同之處在于它們包含有記錄的數(shù)據(jù)。1、選擇Practice文件夾，選擇FileImportExpriments默認(rèn)情況下，當(dāng)導(dǎo)入一個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，D:BDExportExperiment folder將會(huì)出現(xiàn)，除非你以前改變路徑導(dǎo)向到另一個(gè)文件夾。2、選擇命名為Manual Comp的文件夾，點(diǎn)擊Import。導(dǎo)入的實(shí)驗(yàn)都是以文件夾形式出現(xiàn)，

10、文件夾在導(dǎo)入后在瀏覽框中將會(huì)以實(shí)驗(yàn)Expriment出現(xiàn)。注意原先的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有關(guān)閉，新的實(shí)驗(yàn)加在Simple Analysis Experiment后面有三種方法在瀏覽框中增加實(shí)驗(yàn)：1、用瀏覽框工具欄中的快捷鍵來(lái)新建一個(gè)空的實(shí)驗(yàn)（默認(rèn)條件設(shè)置）。2、ExprimentNew Expriment命令新建一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)來(lái)自于一個(gè)原來(lái)保存的模板，模版包含下列部分：點(diǎn)圖、門(mén)、統(tǒng)計(jì)圖和儀器設(shè)置。3、FileimportExpriment命令，可新建一個(gè)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)這個(gè)方法獲得的實(shí)驗(yàn)包括原來(lái)保存的實(shí)驗(yàn)條件等和數(shù)據(jù)。Working with Experiments in the Browser現(xiàn)在在瀏覽框中

11、有三個(gè)實(shí)驗(yàn)，一個(gè)關(guān)閉的實(shí)驗(yàn) (Experiment_001), 一個(gè)打開(kāi)的實(shí)驗(yàn)?zāi)０?Simple Analysis)和一個(gè)關(guān)閉的導(dǎo)入的實(shí)驗(yàn) (Manual Comp)。接下來(lái)的練習(xí)來(lái)證明關(guān)閉和打開(kāi)的實(shí)驗(yàn)之間的不同，以及如何來(lái)比較儀器設(shè)置。1、點(diǎn)擊Manual Comp Experiment前面的（+），展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。盡管在browser框中顯示出實(shí)驗(yàn)組分，但點(diǎn)圖依舊是空白的，你必須打開(kāi)一個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得它的數(shù)據(jù)。注意：展開(kāi)一個(gè)實(shí)驗(yàn)和雙擊打開(kāi)一個(gè)實(shí)驗(yàn)是不同的2、雙擊Manual Comp Experiment來(lái)打開(kāi)Simple Analysis Experiment關(guān)閉，在worksheet中顯示Man

12、ual Comp Experiment中的分析目標(biāo)。3、點(diǎn)擊其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本Manual Comp Experiment中，在每個(gè)樣本下面含有多個(gè)試管，注意每個(gè)試管都是綠色的，說(shuō)明每個(gè)試管都包含有數(shù)據(jù)。4、點(diǎn)擊試管指示到任何一個(gè)試管。在global worksheet中包含有點(diǎn)圖、試管中含有數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)就顯示在worksheet中，可用試管指示來(lái)定位試管，則將顯示所選擇試管的數(shù)據(jù)。5、在browser中選擇其它試管注意：數(shù)據(jù)并沒(méi)有改變，必須依靠試管指示，才能在global worksheet中顯示其他試管的數(shù)據(jù)。嘗試把試管指示指向另一個(gè)試管，注意數(shù)據(jù)的變化。6、展開(kāi)Simple Analysis

13、 Experiment，選擇Instr Settings。注意Inspector上的儀器設(shè)置是所選Instru settings的設(shè)置，盡管實(shí)驗(yàn)已經(jīng)關(guān)閉。7點(diǎn)擊Instrumengt框中的各個(gè)參數(shù)Instrment框顯示了試管指示所對(duì)應(yīng)的試管的儀器設(shè)置（Manual Comp Experiment中的tube）。Inspector顯示的是試管的設(shè)置或者是所選擇的Instr Settings的設(shè)置。在這個(gè)例子里，Inspector顯示的是Simple Analysis Experiment實(shí)驗(yàn)的儀器設(shè)置，你可以用Instrument框和Inspector來(lái)比較瀏覽器中的任何兩個(gè)儀器設(shè)置。顯示的是

14、Manual Comp_001中PE試管的儀器設(shè)置顯示的是simple Analysis_001的instru Settings的儀器設(shè)置Using Gating Features在BD FACSDiva軟件中：可以創(chuàng)建四種類型的門(mén)：polygon、rectangle、quadrant和interval。自動(dòng)圈門(mén)工具Automatic和Snap-To門(mén)工具可用來(lái)設(shè)置polygon和interval門(mén)。在這一節(jié)中，你需要先前所建立的Simple Analysis 和Manual Comp 實(shí)驗(yàn)。Creating Gates這部分說(shuō)明了在Manual Comp Experiment中怎么用work

15、sheet中的菜單欄來(lái)設(shè)不同的門(mén)：1、打開(kāi)Manual Comp Experiment2、把試管指向?qū)?zhǔn)Calibrite樣本下的Pre Sort試管，如下圖：3、在FSC vs SSC點(diǎn)圖上建一個(gè)Autopolygon門(mén)選中worksheet菜單欄的（Autopolygon）工具。在點(diǎn)圖中點(diǎn)擊粒子，一個(gè)門(mén)將會(huì)自動(dòng)地畫(huà)成。4、試管指示指向下一個(gè)試管，可以看到一些粒子在門(mén)外。5、選擇FSC vs SSC圖的Autopolygon門(mén)，Delete按Delete鍵而不是Backspace鍵，如果Delete鍵不工作的話，右擊門(mén)，選擇delete。這將會(huì)激活Delete鍵，下次就可以使用。6、在FSC

16、 vs SSC點(diǎn)圖上創(chuàng)建Snap-To polygon門(mén)Snap-To polygon和autopolygon門(mén)不同，Snap-To polygon門(mén)自動(dòng)重新計(jì)算?？煽匆?jiàn)Snap-To polygon門(mén)的邊框比較粗。7、把試管指示回到Pre Sort 試管，注意門(mén)的變化。8、（可選）用其它設(shè)門(mén)工具進(jìn)行練習(xí)，在點(diǎn)圖上去除Snap-To門(mén)，創(chuàng)建一個(gè)Rectangle門(mén)（）和一個(gè)Polygon門(mén)（）Editing Gates這部分描述怎樣移動(dòng)和改變門(mén)的大小1、選中FSC vs SSC點(diǎn)圖上的門(mén)，在每個(gè)頂點(diǎn)上會(huì)出現(xiàn)一個(gè)把手。2、移動(dòng)選中的門(mén)移動(dòng)門(mén)的時(shí)候，選擇門(mén)的邊，而不是頂點(diǎn)，可看到門(mén)的標(biāo)簽隨著門(mén)一起

17、移動(dòng)3、拖動(dòng)其中的一個(gè)把手來(lái)改變門(mén)的大小在你移動(dòng)或者改變Snap-To門(mén)時(shí)，門(mén)將不會(huì)自動(dòng)調(diào)準(zhǔn)。你可以通過(guò)右擊門(mén)的邊，選擇下拉菜單中的重新計(jì)算。4、通過(guò)拖動(dòng)門(mén)內(nèi)的標(biāo)簽，可把標(biāo)簽拖到門(mén)外5、在門(mén)外點(diǎn)擊，釋放門(mén)6、關(guān)閉Manual Comp Experiment.Subsetting PopulationsSimple Analysis Expriment 包括三個(gè)點(diǎn)圖和一個(gè)Population Hierarchy。Population Hierarchy主要是用來(lái)查看各個(gè)門(mén)內(nèi)群體關(guān)系。在這里，你需要原來(lái)創(chuàng)建的Simple Analysis Experiment，在軟件安裝時(shí)，樣本文件存在于BDEx

18、portFCS文件中。導(dǎo)入數(shù)據(jù)在你進(jìn)行分群前，需要含有數(shù)據(jù)的點(diǎn)圖：1、通過(guò)雙擊來(lái)打開(kāi)Simple Analysis Expriment，只有把實(shí)驗(yàn)打開(kāi)時(shí)，你才能導(dǎo)入數(shù)據(jù)。2、選擇FileImportFCSfiles通常，D:BDExportFCS文件出現(xiàn)，除非你原來(lái)改變過(guò)路徑3、雙擊4色文件，在雙擊Calibrite beads文件夾來(lái)打開(kāi)。4、選擇文件中所有的FCS文件，點(diǎn)擊Import當(dāng)導(dǎo)入FCS文件時(shí)，需要選擇文件，而不是文件夾，可以通過(guò)Shift和Ctrl鍵來(lái)選擇多個(gè)甚至全部。這樣就增加了一個(gè)新的樣本Calibrite Beads，含有四個(gè)帶數(shù)據(jù)的試管。5、在Calibrite bea

19、ds樣本中，把試管指向Tube-0016、在瀏覽框中選擇Tube-001，勾選Inspector中熒光參數(shù)前的Log Checkbox。7、對(duì)Calibrite Specimen實(shí)驗(yàn)的其它試管做相同的操作Defining and Subsetting Populations1、Tube-001的FSC vs SSC點(diǎn)圖上，建立一個(gè)Autopolygon 門(mén)。新的P1群就在Population Hierarchy上出現(xiàn)。2、把標(biāo)簽P1拖出Autopolygon gate（點(diǎn)中P1標(biāo)簽，拖出門(mén)外）。3、建立一個(gè)只顯示P1群的PE直方圖右擊直方圖，選擇show population P1。在直方圖上

20、只顯示P1群體，注意到直方圖上所有的點(diǎn)都是紅色的，是P1的顏色。4、PE直方圖上，在PE陰性峰上創(chuàng)建一個(gè)Autointerval門(mén)（）Population Hierarchy圖上P2群顯示在P1群下面。當(dāng)你在一個(gè)群下創(chuàng)建一個(gè)門(mén)，新的群體是原來(lái)群體的一個(gè)亞群。注意到P2旁邊的顏色框是一個(gè)十字叉，說(shuō)明子群的顏色仍舊是其母群的顏色。默認(rèn)情況下，Interval和Quadrant門(mén)定義的群體一般不會(huì)被授予顏色。5、點(diǎn)擊FITC vs PerCP-Cy5.5點(diǎn)圖，顯示P2群體在點(diǎn)圖上右擊，選擇show population P2點(diǎn)圖是空白的，因?yàn)镻2群體沒(méi)有顏色，下面是給P2群體設(shè)置一個(gè)顏色：1）雙擊P

21、opulation Hierarchy前的顏色框2）選擇一個(gè)顏色6、在 FITC vs PerCP-Cy5.5點(diǎn)圖上建一個(gè)FITC陽(yáng)性的Rectangle門(mén)。擴(kuò)展門(mén)的邊越過(guò)X軸，可以包含有軸的粒子。因?yàn)辄c(diǎn)圖顯示的是P2的群體，新的P3群體是P2群體的一個(gè)子集。下面的步驟顯示另一種建群體的方法。7、設(shè)置FITC vs PerCP-Cy5-5點(diǎn)圖顯示全部的粒子Tip 你也可以用Inspector來(lái)顯示一個(gè)點(diǎn)圖的群體層次結(jié)構(gòu)。8、Population Hierarchy中選擇P2群體，在PerCP-Cy5.5陽(yáng)性群體上畫(huà)一個(gè)Autopolygon門(mén)。結(jié)果如下，可以看出新創(chuàng)建的P4群體是P2群體的一個(gè)

22、子集。在進(jìn)行分群時(shí)為了避免錯(cuò)誤，保持Population Hierarchy可視。在你改變?nèi)后w的名字或者顏色時(shí)，你還是可以選擇群體。Gating Multicolor Experiments下面的教程說(shuō)明了在用人外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析時(shí)，interval和quadrant門(mén)的特性。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞用CD3 FITC, CD16+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC, 和CD8 APC-Cy7進(jìn)行染色進(jìn)行這一步學(xué)習(xí)，您需要6-color Experiment（BDExportExperiment folder）。1、在Practic

23、e folder.中，導(dǎo)入6-Color gating選擇文件夾，選擇File > Import > Experiments，在BDExportExperiment folder中定位6-color gating。選擇文件，點(diǎn)擊導(dǎo)入。2、雙擊實(shí)驗(yàn)，打開(kāi)實(shí)驗(yàn)3、展開(kāi)lymphocytes樣本，試管指向定位在3/16+56/45/4/19/8試管，如下圖。在worksheet點(diǎn)圖中就會(huì)顯示數(shù)據(jù)4、在CD45 vs SSC點(diǎn)圖上，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞上畫(huà)一個(gè)Rectangle門(mén)。Tip：把門(mén)延伸過(guò)點(diǎn)圖的軸，這樣就包含在軸上的點(diǎn)。5、在Population Hierarchy中把門(mén)命名為MNE

24、s（monocytes、neutrophils、eosinophils），選擇P1，輸入MNEs，enter。6、在Population Hierarchy圖中右擊MNEs，選擇 Invert Gate。在Population Hierarchy圖上就增加了一個(gè)新的群體（不包含單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞）。7、右擊FSC vs SSC點(diǎn)圖，選擇顯示populationNoT（MNEs），結(jié)果如下圖。8、在淋巴細(xì)胞上畫(huà)一個(gè)Autopolygon gate ()，在Population Hierarchy上把這個(gè)群體命名為lymphocyte，結(jié)果如下圖，淋巴細(xì)胞是NOT MNEs的一個(gè)子集。I

25、dentifying Lymphocyte Subsets下面就把淋巴細(xì)胞分為T(mén)、B和NK細(xì)胞。1、右擊FSC vs SSC點(diǎn)圖上的淋巴細(xì)胞門(mén)，選擇 Drill down。一個(gè)新的FSC vs SSC圖出現(xiàn)，只顯示淋巴細(xì)胞。在一張點(diǎn)圖上定義了一個(gè)門(mén)后，通過(guò)Drill down就可以創(chuàng)建一個(gè)只顯示門(mén)內(nèi)群體的點(diǎn)圖。2、在新的點(diǎn)圖上，把FSC換成CD3。3、在CD3+細(xì)胞上畫(huà)一個(gè)Interval gate（一般應(yīng)用在直方圖上，在點(diǎn)圖上也適用），命名新的群體叫做T細(xì)胞。4、用類似的方法可以得到B、NK亞群5、按住ctrl鍵，在Population Hierarchy中選擇T、B和NK，右擊，選擇Joi

26、n Gates，在Population Hierarchy圖上就出現(xiàn)一個(gè)新的群體，是T、B、NK細(xì)胞的總合。Calculating Compensation Using Instrument SetupBD FACSDiva軟件可以自動(dòng)的計(jì)算光譜的重疊值，在進(jìn)行補(bǔ)償時(shí)，更加節(jié)約時(shí)間，更加精確。下面介紹如何使用Instrument Setup feature。Setting Up Compensation Controls1、打開(kāi)Experiment_0012、編輯參數(shù)如果計(jì)算機(jī)與儀器相連，打開(kāi)Specimen-001，把試管指針指向Tube-001，在Instrument框中編輯參數(shù)。如果脫機(jī)

27、操作，選擇Expriment下的instrument setting，在Inspector中編輯參數(shù)。3選擇 Instrument-Instrument setup-Create compensation controls。下面的對(duì)話框?qū)⒊霈F(xiàn)4增加或者刪除對(duì)照，定義標(biāo)記特異性對(duì)照，或者可以改變補(bǔ)償控制的順序。5點(diǎn)擊OK6展開(kāi)Compensation Control specimen來(lái)查看補(bǔ)償對(duì)照。Creating an Instrument Configuration在Instrument Setup中，下一步就是記錄數(shù)據(jù)。為了計(jì)算補(bǔ)償，首先要把instrument configuration

28、設(shè)置成符合記錄數(shù)據(jù)的格式。1選擇 Instrument-Instrument Configuration2在Instrument Configuration對(duì)話框中，選擇Add Configuration3在Instrument Configuration對(duì)話框中，輸入2 laser, 4 color，點(diǎn)擊OK注意：確認(rèn)你輸入的名字完全與圖上的相符，如果字符的空格或者大小寫(xiě)與例子不符，在計(jì)算補(bǔ)償時(shí)，就會(huì)有一個(gè)錯(cuò)誤信息。4在instrument configurations列表中，選擇2 laser，4 color，點(diǎn)擊Add Parameter鍵6次instrument configurati

29、on圖應(yīng)該如下所示：5命名laser和detector，輸入每個(gè)參數(shù)的名字首先應(yīng)該確定一個(gè)Detector，再改變參數(shù)的名字?？梢酝ㄟ^(guò)查看其他的configuration來(lái)找到每個(gè)參數(shù)合適的laser和detector。通過(guò)相應(yīng)column的下拉菜單來(lái)選擇所對(duì)應(yīng)的設(shè)置，把參數(shù)的名字改為FSC、SSC、FITC、PE、PerCP和APC。6 點(diǎn)擊okImporting Data and Calculating Compensation現(xiàn)在已經(jīng)設(shè)置好與我們?cè)囼?yàn)相符的confuguration，接下來(lái)就是導(dǎo)入數(shù)據(jù)?？梢杂迷瓉?lái)記錄的數(shù)據(jù)（Sample expriment）來(lái)計(jì)算補(bǔ)償1選擇 Practi

30、ce folder ，從BDExportexperiment folder里導(dǎo)入AutoComp Expriment。選擇File- Import- Experiment，找到AutoComp Expriment 文件夾，點(diǎn)擊Import。2雙擊AutoComp Experiment打開(kāi)實(shí)驗(yàn)這個(gè)實(shí)驗(yàn)包含有一個(gè)Compesation Specimen和四個(gè)熒光參數(shù)的試管3雙擊Unstained Control Tube，打開(kāi)對(duì)應(yīng)的worksheet4 在FSC vs SSC點(diǎn)圖上，移動(dòng)P1門(mén)包含所有的陰性粒子5右擊門(mén)的邊框，選擇Apply to All Compensation Control。

31、6 雙擊第一個(gè)Stained Control Tube（FITC Stained Control），在worksheet打開(kāi)相應(yīng)的點(diǎn)圖。7確定P2門(mén)包含了所有的陽(yáng)性顆粒。P2門(mén)是一個(gè)Snap-To Interval 門(mén)，已經(jīng)包含了所有的陽(yáng)性顆粒。如果一些顆粒在門(mén)外，右擊門(mén)，選擇recalculate。8雙擊下一個(gè)Stained control tube，打開(kāi)相應(yīng)的worksheet。9對(duì)下面的試管，重復(fù)7和8，當(dāng)所有的門(mén)設(shè)定好后，你可以進(jìn)行補(bǔ)償計(jì)算了。10選擇Instrument-Instrument setup-Calculate Compesation。 將會(huì)出現(xiàn)一個(gè)對(duì)話框，可以進(jìn)行命名。

32、11 對(duì)于新的補(bǔ)償進(jìn)行命名，點(diǎn)擊ok。一個(gè)新的設(shè)定，包括了參數(shù)和標(biāo)記信息，閾值和電壓，計(jì)算好的補(bǔ)償。新的儀器設(shè)置儲(chǔ)存在Setup catalog下。Calculating Compensation Manually在進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要導(dǎo)入Manual Comp Experiment，進(jìn)行手動(dòng)補(bǔ)償時(shí)不需要鏈接儀器。Adjusting FITC Compensation這部分描述了怎樣計(jì)算FITC熒光的溢出，其他熒光也是類似的。1選中Compensation Controls Specimen樣本下的FITC Stained Control管。2 在FSC vs SSC點(diǎn)圖上創(chuàng)建一個(gè)Snap-T

33、o gate，如下圖3在worksheet上選擇FSC vs SSC點(diǎn)圖，右擊點(diǎn)圖，選擇Show Populations > P1。4在FITC-A vs PE-A點(diǎn)圖上，畫(huà)一個(gè)FITC陽(yáng)性的Interval gate。在Population Hierarchy view圖上，進(jìn)行重命名為FITC Positive。5在Population Hierarchy view圖上右擊FITC Positive，選擇Invert Gate，重命名為NOT (FITC Positive) population Negative，如下圖6 在Inspector框中顯示補(bǔ)償管，確定Enable Com

34、pensation checkbox 已經(jīng)被選擇。7調(diào)節(jié)PE-%FITC熒光補(bǔ)償，直到，F(xiàn)ITC陽(yáng)性群體的熒光平均值與陰性對(duì)照的相同，如下圖。8用同樣的方法調(diào)節(jié)PerCP-CY5-5-%FITC、APC%FITC的熒光補(bǔ)償，結(jié)果如下圖。其他熒光通道可用相同的方法進(jìn)行調(diào)節(jié)。Manually Constructing a Compensation Matrix進(jìn)行補(bǔ)償完畢后，可以拷貝這些設(shè)置來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1放大Inspetor框，這樣就可以看到整個(gè)補(bǔ)償網(wǎng)絡(luò)。2在Browser框中，右擊FITC Stained Control管，選擇Copy Spectral Overlap。3展開(kāi)Calibrite

35、 Specimen，可以看到五個(gè)試管。4選擇Calibrite Specimen下的5個(gè)管子，右擊試管，選擇Paste Spectral Overlap。在數(shù)據(jù)拷貝后，在瀏覽器中選擇其中一個(gè)Calibrite Tube。在Inspector框中，可以看到FITC的補(bǔ)償網(wǎng)絡(luò)。如下圖5輪流拷貝其它的Spectral Overlap settings，粘貼到這五個(gè)試管。當(dāng)完成后，結(jié)果應(yīng)該如下圖在進(jìn)行補(bǔ)償之后，就可以用相應(yīng)的條件進(jìn)行樣本檢測(cè)Tip：可以進(jìn)行導(dǎo)出和導(dǎo)入的模版：Expriment、Template、Panel Template、Analysis Template、Settings、FCS

36、Files。Exporting Experiments1 在瀏覽框中選擇experiments2 選擇 File > Export > Experiments.3 在Export Experiments對(duì)話框中，進(jìn)行合適的選擇，點(diǎn)擊OK。Importing Experiments1 選擇File > Import > Experiments.2 在對(duì)話框中選擇實(shí)驗(yàn)文件夾或者Zip文件夾。3 選擇需要的文件，點(diǎn)擊Import。Exporting Experiments as Templates1右擊experiment，choose Export > Experim

37、ent Template，Export Wizard dialog出現(xiàn)。2輸入template type和模板名字（模版名字是進(jìn)行區(qū)別的唯一標(biāo)志），點(diǎn)擊next3下面是一些可選項(xiàng)進(jìn)行選擇后，點(diǎn)擊Finish。Import a Template根據(jù)已經(jīng)儲(chǔ)存的模板來(lái)建立一個(gè)實(shí)驗(yàn)（不能用快捷鍵）choose Experiment >New Experiment or press Ctrl-E. 出現(xiàn)Experiment Templates dialog，進(jìn)行選擇你所需的模板，最多可建立50個(gè)拷貝（實(shí)驗(yàn)拷貝）。Exporting a Specimen as a Panel Template1Ri

38、ght-click the specimen、choose Export > Panel Template，Export Wizard dialog出現(xiàn)。2選擇你panel所需要的global worksheet，點(diǎn)擊next。3選擇template type，輸入名字，點(diǎn)擊next。4下面是一些可選項(xiàng)，點(diǎn)擊Finish。Importing a Panel Template選擇Experiment > New Specimen or press Ctrl-M，Panel Templates dialog出現(xiàn)，選擇方式與導(dǎo)入模板類似。進(jìn)行選擇，最多50個(gè)拷貝（樣本拷貝）利用Panel

39、 Template（包含有實(shí)驗(yàn)的儀器設(shè)置，分析方式）可對(duì)其他樣本進(jìn)行分析，但是樣本中所包含的試管數(shù)必須同。右擊specimen，選擇Apply Panel Analysis，出現(xiàn)Panel Template dialog對(duì)話框，進(jìn)行選擇，點(diǎn)擊OK。Exporting a Analysis Template1 Right-click an Analysis icon（）, 或者含有 的tube或者global worksheet， choose Export > Analysis template。Export Wizard dialog出現(xiàn)。2選擇template type，確定名字，點(diǎn)

40、擊next。3下面是可選項(xiàng)，點(diǎn)擊ok。Creating a Tube with a Predefined Analysis Template1Choose Experiment > New Tube or press Ctrl-T。2Analysis Templates dialog出現(xiàn)，進(jìn)行選擇，點(diǎn)擊OK。最多進(jìn)行50個(gè)拷貝（Tube數(shù)）。Creating Specimen- or Tube-Specific Settings1 右擊瀏覽框Cytometer Settings圖標(biāo)()，選擇Export to the Instrument folder。2 輸入文件名稱，點(diǎn)擊Export.3 默認(rèn)情況下文件會(huì)儲(chǔ)存在D:BDExportInstrument中。Importing Settings1 在瀏