實(shí)驗(yàn)2 乙酰膽堿酯酶抑制法快速測(cè)定果蔬中的殘留農(nóng)藥

1、實(shí)驗(yàn)二乙酰膽堿酯酶抑制法快速測(cè)定果蔬中的殘留農(nóng)藥目前有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥是我國大量使用的殺蟲劑，雖然這類農(nóng)藥與過去使用的有機(jī)氯農(nóng)藥相比，降解速度較快，但在果蔬中的殘留仍然較為嚴(yán)重。由于該類農(nóng)藥能抑制人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的生理活性，神經(jīng)傳導(dǎo)因此受阻，引起神經(jīng)麻痹乃至死亡，對(duì)人類健康造成極大危害。對(duì)于果蔬中的農(nóng)藥通常采用氣相色譜等方法進(jìn)行分析，但分析時(shí)間長，操作步驟煩瑣，適用于實(shí)驗(yàn)室分析。長期以來在大部分果蔬市場中，通常采用乙酰膽堿酯酶抑制法進(jìn)行快速檢測(cè)，即以乙酰膽堿酯酶作為檢測(cè)試劑，采用農(nóng)藥殘留檢測(cè)儀，根據(jù)乙酰膽堿酯酶活性變化的程度來測(cè)定果蔬樣品中的殘留農(nóng)藥。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解果蔬中殘留農(nóng)

2、藥的分析方法；2 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3 理解農(nóng)藥殘留性評(píng)價(jià)的意義。二、 實(shí)驗(yàn)原理有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的活性，造成神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的積累，影響正常傳導(dǎo)，使昆蟲中毒致死，酶抑制法就是根據(jù)這一昆蟲毒理學(xué)原理，對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)。以乙酰膽堿為底物，在乙酰膽堿酯酶（ACHE）的作用下，乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，膽堿和二硫雙對(duì)硝基苯甲酸（DNTB）產(chǎn)生顯色反應(yīng)，使反應(yīng)液呈黃色（于410nm處有最大吸收峰）。根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，在沒有有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在時(shí)，底物在酶的催化作用下發(fā)生水解，反應(yīng)速率可以用吸光度值隨時(shí)間的變化率K0

3、來表示。當(dāng)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥加入到酶的顯色體系中時(shí)，農(nóng)藥抑制了酶的活性，影響顯色體系的反應(yīng)速度，此時(shí)體系吸光度隨時(shí)間的變化率為Kt，則有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)酶的活性的抑制率Y的計(jì)算公式如下：Y=率值K0：空白樣品的吸光度隨時(shí)間變化曲Kt：樣品溶液的吸光度隨時(shí)間變化曲率值其中K0和Kt都可通過以下過程進(jìn)行推導(dǎo)和在樣品的測(cè)量過程，選取每隔等步長時(shí)間測(cè)吸光度值，3分鐘內(nèi)共測(cè)定7個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。設(shè)數(shù)據(jù)表：t A1 A12 A23 A34 A45 A56 A6K0-Kt100%K0吸光度AK0線的斜線的斜Kt 計(jì)算。 定一次點(diǎn)如下7 A7則線性回歸所得At曲線的斜率K為：tiAi-K=tiAi712

4、t-i7(ti)2(A1+2A2+3A3+4A4+5A5+6A6+7A7)-(1+2+ +7)(A1+A2+ +A7)=(12+22+ +72)-(1+2+ +7)273(A7-A1)+2(A6-A2)+(A5-A3)28IIIIII3lg(01)+2lg(02)+lg(03)I7I0I6I0I5I0= 28III3lg(1)+2lg(2)+lg(3)I7I6I5=28=由此結(jié)果可以看出，K值的求取可以不需要使用I0值，即實(shí)驗(yàn)中不需要使用蒸餾水來校正I0值，在光源具有穩(wěn)定性的前提下（通過儀器的硬件電路實(shí)現(xiàn)），I0值對(duì)測(cè)量結(jié)果不會(huì)有影響，這樣就可以簡化步驟，只用測(cè)出空白樣品和實(shí)際樣品溶液的光強(qiáng)I

5、1I7，計(jì)算出K0和Kt，最后得出抑制率Y值。采用乙酰膽堿酯酶測(cè)定殘留農(nóng)藥時(shí)，當(dāng)酶完全水解底物乙酰膽堿時(shí)，溶液顯黃色，其抑制率為0，當(dāng)酶活性被農(nóng)藥抑制而部分水解乙酰膽堿，測(cè)定溶液顯淡黃色，出現(xiàn)相應(yīng)的抑制率，當(dāng)酶完全被農(nóng)藥抑制，測(cè)定溶液顯無色，抑制率為100%，這樣就可以建立起農(nóng)藥殘留量與酶活性抑制率之間的關(guān)系。因而可以通過測(cè)定抑制率的大小來顯示農(nóng)藥殘留的毒性程度。樣品的毒性等級(jí)分為：安全、低毒和高毒。毒性等級(jí)和抑制率之間的關(guān)系如下：表4-4 抑制率和毒性等級(jí)的關(guān)系抑制率Y< 20%20%50%> 50% 毒性等級(jí) 安全 低毒 高毒三、 儀器和試劑1 儀器農(nóng)藥殘留檢測(cè)儀 1臺(tái)天平（0

6、.01g） 1臺(tái)組織搗碎機(jī) 1臺(tái)一次性手套 1雙金屬鑷子 1支試管架 1個(gè)移液管架 1個(gè)20mL離心試管 3支10mL具塞試管 4支5mL吸量管 5支1 mL吸量管 3支（或移液槍（50-250L） 1套）2 試劑提取液：將兩袋粉劑倒入500mL瓶內(nèi)，加入510mL蒸餾水，搖勻溶解后備用。稀釋液：將兩袋粉劑倒入250mL瓶內(nèi)，加入100mL蒸餾水，搖勻溶解后備用。酶液：每瓶酶粉加2.6mL稀釋液，搖勻后置4備用，配好的酶液在4下可使用7天。底物：每瓶底物粉劑中加入2.6mL蒸餾水，搖勻后置4備用，配好的底物液在4下可使用3天。冷凍保存可使用15天。顯色劑：將二袋顯色劑粉劑混合瓶內(nèi)，加入32mL

7、稀釋液，搖勻溶解置4下備用。四、 實(shí)驗(yàn)步驟1. 樣品預(yù)處理戴上手套將蔬菜樣品剪成約1cm2，用天平準(zhǔn)確稱取1g剪碎后的蔬菜樣品放入20mL離心試管中，；加入5mL提取液浸沒葉片，不斷搖振5min，靜置20min后，取上清液2.5mL置于10mL具塞試管中待用。2 樣品測(cè)定(1) 空白樣品的測(cè)量：向1支10mL具塞試管中依次加入2.5mL提取液，0.1mL酶液，0.1mL顯色劑，混勻后將試管放入37水浴中放置15分鐘，15分鐘到達(dá)時(shí)，馬上加入0.1mL底物混勻，約1分鐘后倒入比色皿中放入農(nóng)藥殘留檢測(cè)儀進(jìn)行空白測(cè)定，記錄3分鐘內(nèi)儀器顯示的光強(qiáng)值I1、I2、I3、I4、I5、I6、I7，計(jì)算K0。同

8、時(shí)做3份平行樣（每個(gè)樣品至少間隔5min，依次放入水浴中，記錄時(shí)間）。(2) 待測(cè)樣品的測(cè)量：向盛有待測(cè)樣品提取液的具塞試管中，依次加入0.1mL酶液，0.1mL顯色劑混勻，將試管放入37水浴中放置15分鐘，15分鐘到達(dá)時(shí)，馬上加入0.1mL底物混勻，約1分鐘后倒入比色皿中放入農(nóng)藥殘留檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)定，記錄3分鐘內(nèi)儀器顯示的光強(qiáng)值I1、I2、I3、I4、I5、I6、I7，計(jì)算Kt。同時(shí)做3份平行樣（每個(gè)樣品至少間隔5min，依次放入水浴中，記錄時(shí)間）。并且計(jì)算樣品的抑制率Y，判斷毒性等級(jí)。五、 數(shù)據(jù)處理通過下列公式計(jì)算蔬菜樣品的抑制率，并判斷毒性等級(jí)。3lg(K0i=II1I)+2lg(2)+lg(3)I7I6I5 (i=1,2,3) 28K0=K01+K02+K03 33lg(Kti=I'I1'I')+2lg(2)+lg(3)I7'I