低分子肝素分子量及其分布的測(cè)定

1、    低分子肝素分子量及其分布的測(cè)定        摘要目的：建立一種低分子肝素分子量及其分布測(cè)定的質(zhì)量控制方法。方法：采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC），色譜柱為Shodex Asahipak GF-510HQ（7.6mm×300mm）或TSK G3000SWxl（7.8mm×300mm）,理論塔板數(shù)以葡萄糖峰計(jì)算分別為15 206和15 731；柱溫35；流速0.5ml.min-1；示差折光檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器聯(lián)用，檢測(cè)波長(zhǎng)為234nm。結(jié)果：

2、測(cè)得兩個(gè)低分子肝素樣品的重均分子量和分子量分布。結(jié)論：HPGPC具有簡(jiǎn)便、快速和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，適合于該類藥物的質(zhì)量控制。 關(guān)鍵詞低分子肝素；高效凝膠滲透色譜法；分子量；分子量分布Measurement of molecular weight and molecular weight distribution of low molecular weight heparinFan Huihong（Fan HH）,Liu Jinxiu（Liu JX）, Xu Kangsen（Xu KS）（National Institute for the Control of Pharmaceutical an

3、d Biological Products. Beijing,100050）ABSTRACTOBJECTIVE: To develop a method for the quality control of low molecular weight heparin.METHODS:Molecular weight and molecular weight distribution of LMWH was determined by high performance gel permeation chromatography（HPGPC）on Shodex Asahipak GF-510HQ c

4、olumn or TSK G3000SWxl column at 35with 2.84%（pH5.0）sodium sulfate as the mobile phase,It was detecled by RI and UV detector at 234nmThe flow rate of the mobile phase was 0.5ml.min-1.RESULTS:The molecular weight and molecular weight distribution of two LMWH samples were obtained. RSD was less than 1

5、%.CONCLUSION:The method is simple with good reproducibility（RSD <1%）and practicible for the control of the medicine.KEYWORDSlow molecular weight heparin, HPGPC, molecular weight , molecular weight distribution低分子肝素（low molecular weight heparin,簡(jiǎn)稱LMWH）是近十幾年發(fā)展起來(lái)的新一代肝素類抗血栓藥物，其抗血栓作用優(yōu)于肝素，而抗凝血作用卻低于肝素，其

6、具有生物利用度高，體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，出血傾向小，口服易吸收等特點(diǎn)，目前已廣泛用于臨床。LMWH是指一類產(chǎn)品，由于LMWH生產(chǎn)方法不同和生產(chǎn)原料的差異，使得該類產(chǎn)品存在以下區(qū)別：分子量及其分布不同，F(xiàn)Xa/FIIa值不同，鈉鹽和鈣鹽的不同。LMWH一般指重均分子量在8000以下，低于8000的級(jí)分含量不得少于60%的糖胺聚糖硫酸鹽且FXa/FIIa不低于1.51。分子量及其分布是LMWH產(chǎn)品的重要質(zhì)量控制指標(biāo)。目前用于LMWH分子量及其分布測(cè)定的方法有：粘度法，凝膠色譜法，聚丙烯酰胺凝膠電泳法，13C-NMR和光散射法。其中高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）具有簡(jiǎn)便、快速和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，已開始用于多

7、糖類藥品的質(zhì)量控制。本研究根據(jù)英國(guó)藥典1和歐洲藥典2的方法，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)34，通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立了HPGPC測(cè)定低分子肝素分子量及其分布，獲得了滿意結(jié)果，為該類藥物質(zhì)量控制提供依據(jù)。1材料與方法1.1藥品與試劑藥品：LMWH標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（EPCRS），其數(shù)均分子量Mna為3700，歐洲藥典委員會(huì)生物標(biāo)準(zhǔn)品中心。低分子肝素樣品分別為：德國(guó)基諾藥廠（Knoll）提供的肝素鈉Clivarin，批號(hào)30901，28101，33801；廣東天普生物化學(xué)制藥有限公司提供的低分子肝素鈣，批號(hào)J970101，970101A，970101B。試劑：疊氮化鈉(NaN3)為進(jìn)口超純?cè)噭粺o(wú)水硫酸鈉；無(wú)水葡萄糖為國(guó)產(chǎn)分析純

8、試劑。1.2儀器日本島津LC-10AT泵，RI-6A示差折光檢測(cè)器，SPD-MXA二極管陣列檢測(cè)器，CBM-10A接口，DGU-4A脫氣裝置，CTO-10A恒溫柱箱，CLASS-LC10系統(tǒng)軟件和GPC專用軟件。Millipore超純水器。1.3溶液的配制流動(dòng)相：配制2.84%硫酸鈉的水溶液（內(nèi)含0.02%NaN3），以1mol.L-1硫酸調(diào)pH為5.0，0.45m濾膜過(guò)濾。 標(biāo)準(zhǔn)品溶液：稱取EPCRS 10mg，加流動(dòng)相1ml使其溶解。供試品溶液：稱取LMWH樣品10mg，加流動(dòng)相1ml使其溶解。1.4系統(tǒng)校正首先將儀器按順序連接，色譜柱的出口接紫外檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器出口接示差折光檢測(cè)器。然

9、后按以下色譜條件進(jìn)行系統(tǒng)校正。色譜柱為Shodex Asahipak GF-510HQ（7.6mm×300mm）用于Knoll樣品測(cè)定，TSK G3000SWxl（7.8mm×300mm）用于廣東天普樣品測(cè)定，理論塔板數(shù)以葡萄糖峰計(jì)算分別為15206和15731；柱溫35；流速0.5ml.min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為234nm。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液25l進(jìn)樣，同時(shí)記錄兩檢測(cè)器色譜，精確測(cè)出樣品到達(dá)兩檢測(cè)器的時(shí)間差，將兩色譜時(shí)間對(duì)準(zhǔn)得到色譜柱的校正曲線，校正中用的保留時(shí)間以示差折光檢測(cè)器的保留時(shí)間為準(zhǔn)。按以下公式計(jì)算：rRI/UV234（1）fMna/r（2）MifRIi/UV234i（3

10、）其中：RI和UV234分別為示差折光檢測(cè)器色譜中有效峰的總面積和紫外檢測(cè)器色譜中有效峰的總面積。Mna為EPCRS的數(shù)均分子量3700；RIi和UV234i分別為i時(shí)間點(diǎn)兩檢測(cè)器色譜的峰高，Mi為i時(shí)間點(diǎn)的分子量。均勻選擇57個(gè)Mi與對(duì)應(yīng)的Rti作線性回歸，得到分子量對(duì)數(shù)值與保留時(shí)間的線性方程，確保相關(guān)系數(shù)r大于0.99。即獲得色譜柱的校正曲線。1.5樣品測(cè)定供試品溶液25l進(jìn)樣，記錄示差折光檢測(cè)器色譜，按下式計(jì)算樣品的重均分子量重均分子量。重均分子量RIiMi/RIi （4）本研究采用島津GPC軟件進(jìn)行樣品分子量及其分布計(jì)算。2結(jié)果與討論2.1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品EPCRS分別經(jīng)上述兩色譜柱分離得到

11、示差折光檢測(cè)器色譜和紫外檢測(cè)器色譜。根據(jù)系統(tǒng)校正由色譜中有效峰的總面積計(jì)算得到r值分別為0.1490（GF-510HQ柱）和0.1629（TSK G3000SWxl柱），f值為24832和22713。校正曲線的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)分別為0.9975和0.9958，由此說(shuō)明本研究所用的兩色譜柱均適合LMWH的分離。2.2根據(jù)兩供試品示差折光檢測(cè)器色譜，由島津GPC專用軟件計(jì)算得到兩供試品重均分子量及其分布測(cè)定結(jié)果見表1。2.3Knoll樣品本研究方法測(cè)定結(jié)果與本品在德國(guó)測(cè)定的結(jié)果基本一致（如表1所示），說(shuō)明本研究設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)處理方法是合理的，測(cè)定結(jié)果是可靠的。建議本研究方法可以作為低分子肝素分子

12、量測(cè)定用的質(zhì)量控制方法。表1LMWH重均分子量及分子量分布n3批號(hào)重均分子量±RSD低于8000級(jí)分的含量（%）±RSD281014525±0.5%（4167）90.8±0.2%（93.0）309014667±0.5%（4275）90.6±0.2%（93.0）338014735±0.5%（4151）90.2±0.2%（94.0）J9701014979±0.2%87.6±0.1%J970101A4695±0.1%87.7±0.1%J970101B4644±0.2%88

13、.0±0.1%注：（）內(nèi)為德國(guó)測(cè)定結(jié)果 2.4由于EPCRS對(duì)于分子量大于10 000的肝素分子量測(cè)定誤差大，已有文獻(xiàn)報(bào)道其局限性，日本等國(guó)已研制出新的標(biāo)樣4。WHO已建立LMWH活性測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)品3，但國(guó)際上至今還沒(méi)有統(tǒng)一的分子量標(biāo)準(zhǔn)品。我們正在著手國(guó)內(nèi)肝素分子量測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)品的研制工作，準(zhǔn)備建立一種只需單一檢測(cè)器測(cè)定同時(shí)可以用普通GPC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的HPGPC，這樣可以拓寬檢品范圍，節(jié)約檢驗(yàn)費(fèi)用，方法也易于推廣。3結(jié)論本研究首次解決了LMWH分子量及其分布測(cè)定數(shù)據(jù)處理的難題，建立的HPGPC具有簡(jiǎn)便、快速和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，適于該類藥品的質(zhì)量控制。作者單位：范慧紅劉金秀徐康森（北京100050 中國(guó)藥品生物制品檢定所）參考文獻(xiàn)1英國(guó)藥典1993年版增補(bǔ)本（1994）：1335.2歐洲藥典1997年版：828.3Neilsen JHA convenient method for molecular mass determination of heparinThro